骨髓間充質(zhì)干細胞誘導分化和心肌內(nèi)移植的實驗研究.pdf

1、骨髓間充質(zhì)干細胞是一類可進行自我復制和更新的細胞，在一定條件下能夠跨胚層向骨、軟骨、脂肪、神經(jīng)、肌肉等多種譜系分化。多項研究證明，間充質(zhì)干細胞移植入缺血心臟后可以分化形成新生心肌細胞、血管內(nèi)皮細胞和神經(jīng)細胞等，還可通過分泌多種生長因子，促進微循環(huán)建立，增加血液灌注，提高梗死后心臟功能。將間充質(zhì)干細胞的多向分化特性應用于臨床治療，可能為心肌梗死后的慢性心力衰竭患者帶來新希望。 間充質(zhì)干細胞可在體外培養(yǎng)中被誘導分化為心肌樣細胞，具備

2、心肌細胞的部分表型，表達心肌特異物質(zhì)，甚至產(chǎn)生自發(fā)跳動。但是有關(guān)人間充質(zhì)干細胞在體外誘導分化為心肌樣細胞的實驗較少，誘導后的干細胞在形態(tài)學、組織學以及分子生物學方面會有何種改變尚缺乏相關(guān)實驗證據(jù)。 干細胞分化是外界刺激和細胞內(nèi)特異性信號轉(zhuǎn)錄調(diào)控的共同作用結(jié)果。研究發(fā)現(xiàn)，成體干細胞分化為心肌樣細胞的過程類似胚胎時期的表現(xiàn)，某些心肌發(fā)育調(diào)控基因在這一過程中再次被激活，但其表達規(guī)律如何尚未被闡明。Cripto-1是胚胎心肌發(fā)育時期不可

3、缺少的調(diào)控因子，但在成體干細胞分化中是否表達尚無相關(guān)研究報道。結(jié)合現(xiàn)有的研究進展，我們希望通過誘導純化人骨髓間充質(zhì)干細胞分化為心肌樣細胞的實驗，試圖在以下幾方面有所發(fā)現(xiàn)：(1)5-氮胞苷能否誘導人間充質(zhì)干細胞分化為心肌樣細胞?(2)在誘導后不同時間點，細胞的形態(tài)、超微結(jié)構(gòu)以及心肌標志物的表達有何差異?(3)Cripto-1是否也作為調(diào)控因子參與成體干細胞的分化?希望通過上述問題的研究為闡明干細胞的分化現(xiàn)象和目的 1．分離、培養(yǎng)

4、較為純化的人骨髓間充質(zhì)干細胞：2．觀察經(jīng)5-氮胞苷誘導后不同時間點細胞的形態(tài)改變：3．分別研究誘導后不同時間心肌特異標志物在RNA和蛋白水平的表達變化；4．研究Cripto-1在干細胞分化為心肌樣細胞過秸中是否表達及其表達規(guī)律。 方法 1．人骨髓間充質(zhì)干細胞的分離和純化培養(yǎng) 常規(guī)方法自成人髂后上嵴抽取骨髓約5ml，用生理鹽水將骨髓液稀釋，室溫下500轉(zhuǎn)/分，離心5分鐘，將上清液吸出并緩慢加在等體積的Perc

5、oll分離液上，室溫下400g，離心30分鐘。將白色薄膜狀細胞層吸出，用PBS(pH7.4)洗3遍(1000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘)，棄去液體，用培養(yǎng)基吹打離心管底部的細胞沉淀，均勻散開后，取10μl滴于細胞計數(shù)板上，置于顯微鏡下計數(shù)細胞個數(shù)。調(diào)整細胞濃度為1×10<'5>/ml并接種于6孔培養(yǎng)板中，置于37℃、含5％C0<,2>的飽和濕度恒溫箱中培養(yǎng)。3天后進行首度換液，以后每隔3～4天換液一次，當細胞生長匯合達80％左右時，用0.25％

6、的胰蛋白酶進行消化傳代。連續(xù)傳至第3代后，可以獲得比較純化的間充質(zhì)干細胞。 2．骨髓間充質(zhì)干細胞的體外誘導 當間充質(zhì)干細胞傳至第3代時，在傳代后的第2天向培養(yǎng)基中加入5-aza，調(diào)整終濃度為10 μmol/l，孵育24小時后更換培養(yǎng)基，并于再次傳代后以相同條件重復誘導一次。 3．形態(tài)學觀察 分別在誘導前以及誘導后的不同時間，在倒置相差顯微鏡下對比觀察在細胞體積、形態(tài)、生長方式、排列方向和細胞間連接等各方

7、面的變化，以及肌節(jié)、肌管樣結(jié)構(gòu)的建立等。 4．流式細胞檢測 應用異硫氰酸熒光素(FITC)標記的抗體檢測第3代細胞中CD34和CDl3的陽性表達百分率。5 免疫熒光檢測取5-氮胞苷誘導4周后的細胞，分別加入抗心肌肌球蛋白重鏈(myosin heavychain，MHC)多克隆抗體、抗心肌肌鈣蛋白I(cardiac troponin I，cTn-I)單克隆抗體、抗心肌轉(zhuǎn)錄因子GATA4多克隆抗體以及抗心肌增強因子2(my

8、ocardiumenhance factor 2，MEF2)多克隆抗體，再加入羅丹明熒光素(TRITC)標記的二抗，在熒光倒置顯微鏡下觀察表達情況。 6．免疫印記(western blot)檢測 分別取誘導后1周、2周、3周和4周的細胞，提取細胞總蛋白，經(jīng)過SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離、轉(zhuǎn)膜、蛋白印記、DAB顯色等步驟，檢測cTn-I、GATA4、MEF2和Cripto-1的表達，并經(jīng)凝膠成像分析

9、系統(tǒng)半定量檢測表達水平。 7．實時熒光定量聚合酶鏈式反應(real-time PCR)檢測 分別在誘導后1周、2周、3周和4周時提取細胞總RNA，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄反應(RT)得到eDNA，以3-磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)作為管家基因，通過real-timePCR技術(shù)檢測cTn-I、GATA4、Nkx2-5和Cripto-1的表達。 8．透射電鏡檢查 將3％戊二醛固定的細胞，依次經(jīng)1％鋨酸固定，梯度乙醇脫水，

10、環(huán)氧樹脂包埋等步驟，制作厚約50～80nm的超薄切片，醋酸雙氧鈾和檸檬酸鉛溶液染色，置于銅網(wǎng)上，在H-800透射電鏡下以80～100KV加速電壓，觀察細胞超微結(jié)構(gòu)變化，并選取典型視野拍照。 結(jié)果 1．5-aza誘導前后的干細胞形態(tài)學變化 原代細胞呈多形性，體積較小，胞核不明顯。流式細胞檢測顯示細胞表達間充質(zhì)干細胞表面標志CD13，幾乎不表達造血干細胞表面標志CD34。第3代細胞形態(tài)均一，為長梭狀，貼壁較緊密，胞核

11、大而圓，核漿比較大，呈漩渦樣生長，細胞間界限清晰。在加入5-aza 24小時后觀察，部分細胞死亡。誘導后1周時，細胞形態(tài)和生長方式無顯著變化，但可見有少量肌節(jié)樣結(jié)構(gòu)形成。誘導2周后，細胞形態(tài)變狹長，體積增大，生長方式由明顯的漩渦狀逐漸變?yōu)槠叫信帕袪?，同時肌節(jié)樣結(jié)構(gòu)增多，可見細胞間融合現(xiàn)象。誘導3周后，細胞間排列更為緊密，生長方向一致，有肌管樣結(jié)構(gòu)形成。誘導4周后，形態(tài)改變不明顯。 2．免疫熒光檢測誘導后細胞表達心肌特異標志物在

12、熒光倒置顯微鏡下觀察，未經(jīng)誘導的細胞中cTn-I和MHC未見表達，誘導4周后可檢測到30％的細胞中有陽性表達，表現(xiàn)為胞漿區(qū)呈紅色熒光，而胞核不著色。在未經(jīng)誘導的細胞中GATA4和MEF2無表達；誘導4周后，部分細胞胞核區(qū)可見GATA4和MEF2陽性，而胞漿不著色。 3．免疫印記技術(shù)檢測誘導前后心肌特異標志物在蛋白水平的表達 心肌特異標志物cTn-I以及心肌特異轉(zhuǎn)錄因子GATA4、MEF2在未經(jīng)誘導組和誘導后1周組的細胞中均

13、未檢測到表達；在誘導后2周組，cTn-I、GATA4、MEF2有微弱表達；在誘導后3周組，GATA4、MEF2、cTn-I的表達較前升高；在誘導后4周組的細胞中，各檢測指標與前比較表達未再增強。 Cripto-1在誘導后1周時，表達水平最高，第2、3周時表達減少，第4周時幾乎檢測不到。 4．real-time PCR檢測誘導后不同時間心肌標志物及心肌發(fā)育調(diào)控因子在RNA 水平的表達差異 在誘導后1周時，細胞

14、開始微弱表達GATA4、Nkx2.5和cTn-I。誘導2周、3周和4周后，GATA4、Nkx2．5和cTn-I的表達水平持續(xù)升高。在誘導后4個不同時間點之間比較，各檢測位點表達水平之間具有顯著差異。 Cripto-1的表達水平在誘導后l周達到峰值，隨后迅速下降，誘導后4個時間點的水平之間差異明顯。 5．透射電鏡檢查 在誘導后的部分細胞胞質(zhì)中出現(xiàn)肌絲樣結(jié)構(gòu)，Z線物質(zhì)散在其中，部分細胞之間可見類似閏盤樣的連接結(jié)構(gòu)形