GFP轉(zhuǎn)基因骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的定向誘導(dǎo)分化及腦內(nèi)移植的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、帕金森病是老年人常見(jiàn)的神經(jīng)退行性疾病,其病理學(xué)基礎(chǔ)為中腦黑質(zhì)向紋狀體投射的多巴胺能神經(jīng)元進(jìn)行性退變,造成腦內(nèi)多巴胺含量減少,從而引起震顫、肌張力增高及運(yùn)動(dòng)障礙等一系列臨床表現(xiàn)。目前多采用藥物治療,但不能根治該病的發(fā)展。
　　 細(xì)胞移植治療帕金森病的實(shí)驗(yàn)研究已開(kāi)展多年,有的采用胚胎中腦細(xì)胞或腎上腺髓質(zhì)細(xì)胞移植,雖有一定的療效,但不持久,因?yàn)槭羌?xì)胞存活時(shí)間不長(zhǎng)。而干細(xì)胞移植可針對(duì)性地補(bǔ)充退變的多巴胺能神經(jīng)元,是治療帕金森病的理想方法

2、,但一直難以找到合適的細(xì)胞來(lái)源。近年來(lái)發(fā)現(xiàn)神經(jīng)干細(xì)胞可以增殖并分化為多巴胺能神經(jīng)元,是理論上合適的供體細(xì)胞,但是胚胎神經(jīng)干細(xì)胞的取材存在倫理學(xué)上的問(wèn)題,成體神經(jīng)干細(xì)胞含量少且不易取材,這些都限制了神經(jīng)干細(xì)胞在治療神經(jīng)退行性病變中的應(yīng)用。
　　 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(Bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)是一種具有自我更新和多向分化潛能的未分化細(xì)胞,可以分化為三個(gè)胚層來(lái)源的細(xì)胞,在特定誘導(dǎo)條

3、件下,BMSCs可分化為神經(jīng)細(xì)胞,尤其是分化為多巴胺能神經(jīng)元,用于移植治療帕金森病可避免法律和倫理學(xué)上的麻煩,這些優(yōu)點(diǎn)使得BMSCs成為細(xì)胞移植的新的供體來(lái)源。但是目前尚無(wú)有效方法將BMSCs誘導(dǎo)分化為多巴胺能神經(jīng)元。
　　 紋狀體是中腦黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元投射的靶組織,在胚胎發(fā)育過(guò)程中,中腦神經(jīng)元軸突逐漸投射到紋狀體,在紋狀體組織微環(huán)境的誘導(dǎo)下,這些神經(jīng)元分化為功能明確的多巴胺能神經(jīng)元。研究表明,紋狀體內(nèi)含有多種神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子和神

4、經(jīng)誘導(dǎo)因子,對(duì)中腦多巴胺能神經(jīng)元的生長(zhǎng)和發(fā)育起重要作用。本實(shí)驗(yàn)室曾經(jīng)用紋狀體提取液或紋狀體組織塊將胚胎干細(xì)胞及神經(jīng)干細(xì)胞成功誘導(dǎo)分化為多巴胺能神經(jīng)元。鑒于上述思考,本研究設(shè)計(jì)以下實(shí)驗(yàn)檢測(cè)紋狀體組織微環(huán)境對(duì)BMSCs的定向誘導(dǎo)分化作用。在體外實(shí)驗(yàn)中,制備了紋狀體提取液檢測(cè)其對(duì)BMSCs的誘導(dǎo)作用；在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中,將BMSCs移植到腦紋狀體內(nèi),觀察在體紋狀體組織微環(huán)境對(duì)BMSCs的定向誘導(dǎo)分化作用。
　　 眾所周知,普通的BMSCs移

5、植到鼠腦后,由于無(wú)法區(qū)分供體細(xì)胞和受體組織而難以準(zhǔn)確檢測(cè)到BMSCs的分化及分布情況。為了識(shí)別移植細(xì)胞,在以往的移植實(shí)驗(yàn)中多采用二苯甲酰胺(Bis benzamide,BBZ)或5-溴脫氧尿嘧啶核苷(5-bromo-2-deoxyuridine,Brdu)來(lái)標(biāo)記細(xì)胞。但研究表明BBZ和Brdu可能會(huì)擴(kuò)散進(jìn)入供體細(xì)胞,且隨著細(xì)胞分裂標(biāo)記物會(huì)逐漸稀釋,難以準(zhǔn)確示蹤。為了準(zhǔn)確示蹤及分析BMSCs的體內(nèi)存活和分化情況,我們從GFP(green

6、fluorescentprotein)轉(zhuǎn)基因鼠取材了BMSCs,即GFP-BMSCs。GFP轉(zhuǎn)基因鼠來(lái)源的BMSCs的GFP基因會(huì)隨著細(xì)胞分裂、增殖傳遞到子代細(xì)胞中,在細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá),且終生存在。標(biāo)記細(xì)胞在熒光顯微鏡下可直接檢測(cè)到,易于追蹤移植BMSCs在腦內(nèi)的存活、分化與遷移情況。
　　 本實(shí)驗(yàn)用取自GFP轉(zhuǎn)基因鼠的BMSCs,進(jìn)行了體內(nèi)和體外定向誘導(dǎo)分化的實(shí)驗(yàn)研究。在體外實(shí)驗(yàn)中,采用全骨髓細(xì)胞接種貼壁培養(yǎng)法培養(yǎng)GFP-BMS

7、Cs,并應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)傳代細(xì)胞CD29、CD11b的表達(dá)情況進(jìn)行細(xì)胞鑒定:制備紋狀體提取液,將紋狀體提取液加入GFP-BMSCs的培養(yǎng)基中作為實(shí)驗(yàn)組,觀察細(xì)胞生長(zhǎng)及分化情況,正常培養(yǎng)的GFP-BMSCs作為對(duì)照組。應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)紋狀體提取液對(duì)GFP-BMSCs的細(xì)胞周期的影響,行免疫細(xì)胞化學(xué)染色技術(shù)檢測(cè)GFP-BMSCs表達(dá)神經(jīng)元特異性烯醇化酶(neuron-specific enolase,NSE)、膠質(zhì)纖維酸性蛋白(glia

8、l fibrillary acidic protein,GFAP)及酪氨酸羥化酶(tyrosinehydmxylase,TH)的情況,以檢測(cè)其分化狀況。
　　 在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中,將GFP-BMSCs通過(guò)立體定位儀植入大鼠腦紋狀體,分別在移植術(shù)后的1d、7d、14d、28d及45d灌注取腦,經(jīng)過(guò)固定沉糖后做冰凍切片,觀察GFP-BMSCs在腦內(nèi)的存活與分布情況,并采用免疫組織化學(xué)染色技術(shù)檢測(cè)移植細(xì)胞分化為神經(jīng)元、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞及多巴胺能

9、神經(jīng)元的情況。
　　 結(jié)果顯示,體外培養(yǎng)的GFP-BMSCs在熒光顯微鏡下呈現(xiàn)綠色,傳代培養(yǎng)的細(xì)胞呈現(xiàn)均一的長(zhǎng)梭形并排列成梳狀、細(xì)胞密集處呈現(xiàn)旋渦狀或團(tuán)狀等骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞典型的形態(tài)特征。流式細(xì)胞術(shù)顯示取材的細(xì)胞表達(dá)CD29,而基本不表達(dá)CD11b,顯示細(xì)胞純度較高。細(xì)胞生長(zhǎng)曲線(xiàn)顯示第3代BMSCs具有良好的增殖能力。加入紋狀體提取液后細(xì)胞生長(zhǎng)良好,部分細(xì)胞長(zhǎng)出突起,呈現(xiàn)神經(jīng)細(xì)胞樣。流式細(xì)胞術(shù)分析顯示紋狀體提取液可促進(jìn)GFP-B

10、MSCs從G0／G1期向S期轉(zhuǎn)化,即促進(jìn)細(xì)胞DNA復(fù)制和蛋白質(zhì)的合成。免疫細(xì)胞化學(xué)染色結(jié)果顯示,實(shí)驗(yàn)組培養(yǎng)細(xì)胞可檢測(cè)到NSE、GFAP及‘TH的表達(dá),其中NSE陽(yáng)性率為37.00±4.29％,GFAP陽(yáng)性率為14.56±2.49％,TH陽(yáng)性率為15.00±3.83％；對(duì)照組細(xì)胞NSE陽(yáng)性率為2.30±0.77％,未檢測(cè)到GFAP和TH的表達(dá)。實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組結(jié)果比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(三種染色結(jié)果分析均p<0.01.),即紋狀體提取液能誘導(dǎo)G

11、FP-BMSCs向神經(jīng)細(xì)胞方向分化,尤其是多巴胺能神經(jīng)元。
　　 體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,GFP-BMSCs移植到腦紋狀體后存活良好,可觀察到明顯的移植區(qū)。隨著移植時(shí)間的延長(zhǎng),部分GFP-BMSCs從移植區(qū)遷移至紋狀體,并分化為NSE、GFAP和TH陽(yáng)性細(xì)胞,表明移植細(xì)胞可分化為神經(jīng)元及神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞并能在紋狀體內(nèi)分化為多巴胺能神經(jīng)元。細(xì)胞移植后大部分分布于紋狀體,也有少量的移植細(xì)胞可見(jiàn)于皮層、側(cè)腦室和胼胝體等處。
　　 綜上所