去甲腎上腺素促進(jìn)內(nèi)皮祖細(xì)胞動(dòng)員的機(jī)制研究.pdf

1、目的:EPCs的動(dòng)員機(jī)制存在多個(gè)環(huán)節(jié)，如黏附、降解、運(yùn)動(dòng)、遷移等。在機(jī)體某些生理或病理狀態(tài)下，外周血中EPCs的數(shù)量和功能也會(huì)發(fā)生變化。去甲腎上腺素是人體交感神經(jīng)的主要的神經(jīng)遞質(zhì)之一。其對(duì)于EPCs動(dòng)員的影響仍不是十分清楚。本研究的目的是：探討NE對(duì)肢體缺血C57小鼠EPCs動(dòng)員的影響，以及對(duì)體外培養(yǎng)的人EPCs的增殖、遷移能力的影響；探討MAPK信號(hào)通路介導(dǎo)NE的促進(jìn)EPCs的作用以及beta-arrestin2在EPCs功能調(diào)節(jié)中的

2、作用。
　　 方法:
　　 本課題從在體實(shí)驗(yàn)水平、細(xì)胞實(shí)驗(yàn)水平和分子調(diào)控機(jī)制等多個(gè)層面逐層深入研究NE調(diào)節(jié)EPCs動(dòng)員的機(jī)制。
　　 (1)在體實(shí)驗(yàn)：采用結(jié)扎股動(dòng)脈的方法制備左下肢缺血的小鼠模型，于術(shù)后的第1至5天每天給予藥物腹腔注射，具體藥物以下：NE10-8mol、α阻滯劑酚妥拉明10-8mol、betal受體阻滯劑美托洛爾10-8mol和beta2受體阻滯劑10-8mol。于術(shù)后第7天取骨髓單個(gè)核細(xì)胞、脾臟

3、細(xì)胞和小鼠外周血單個(gè)核細(xì)胞，流式檢測(cè)CD34+KDR+的細(xì)胞所占的比率。
　　 (2)細(xì)胞功能學(xué)研究：在體外培養(yǎng)人外周血EPCs的培養(yǎng)基中加入不同濃度的NE(0、0.01、0.1、1、10、100μM)干預(yù)72小時(shí)， MTT評(píng)價(jià)EPCs的增殖能力，Transwell小室實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)EPCs的遷移能力。
　　 (3)細(xì)胞信號(hào)研究：Western-blot檢測(cè)檢測(cè)絲裂原激活蛋白激酶(MitogenActivated Protei

4、n Kinase，MAPK)，即細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶Erk1/2、c-Jun氨基端激酶Jnk和p38 MAPK的磷酸化水平。
　　 (4)細(xì)胞信號(hào)通路的蛋白調(diào)控機(jī)制研究：隨機(jī)選取4名對(duì)照者和4名糖尿病患者的外周血30ml，分離PBMCs，Western-blot檢測(cè)beta-arrestin2的表達(dá)。基因沉默的方法干擾EPCs beta-arrestin2的表達(dá)，Realtime PCR和Western-blot的方法評(píng)價(jià)沉默的效

5、率，采用MTT何Transwell小室實(shí)驗(yàn)的方法研究beta-arrestin2在EPCs增殖能力和遷移能力的調(diào)控中的作用。
　　 結(jié)果:
　　 (1)在體實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：NE能夠顯著地促進(jìn)肢體缺血C57小鼠骨髓EPCs的增殖以及其動(dòng)員進(jìn)外周血的能力。注射了NE組的C57小鼠骨髓的EPCs的數(shù)量從2.0±0.4％增加到4.7±0.9％，p＜0.05，動(dòng)員進(jìn)外周血的EPCs的數(shù)量從1.2±0.6％增加到6.2±1.9％，p＜0.

6、05，脾臟的EPCs的數(shù)量從2.5±0.8％增加到3.1±1.0％，p＜0.05。而NE的這種作用能夠被α腎上腺素受體阻斷劑酚妥拉明和beta2腎上腺受體阻斷劑I127阻斷，但是不能被betal腎上腺素受體阻斷劑阻斷。
　　 (2)細(xì)胞功能學(xué)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：NE能夠濃度依賴性地促進(jìn)體外培養(yǎng)的EPCs的增殖，其中以NE10μM的作用最強(qiáng)，其增殖率為103.6±54.6％，P＜0.05，NE的促進(jìn)EPCs增殖作用能夠被酚妥拉明和I127阻

7、斷，但是不能被美托絡(luò)爾阻斷。另外ERK1/2抑制劑A6355和eNOS抑制劑L-NAME能夠阻斷也能夠阻斷NE的這種作用，P＜0.05，但是JNK抑制劑SP600125、p38抑制劑PD169318、PI3K抑制劑LY1940021μM、、p65抑制劑RO106-9920和NO供體SNP均無(wú)類似作用，P＞0.05。NE能夠顯著地促進(jìn)EPCs的遷移能力(124.1±12.2 VS71.7±19.6，P＜0.05)，酚妥拉明和I127能夠阻

8、斷NE的促遷移能力(57.2±14.3 VS124.1±12.2，P＜0.05和61.3±11.5 VS124.1±12.2，P＜0.05)，而美托洛爾無(wú)類似作用(112.8±26.0 VS124.1±12.2，P＞0.05)。
　　 (3)細(xì)胞信號(hào)通路的研究發(fā)現(xiàn)：NE能夠濃度依賴性地增加EPCs的Erk1/2和信號(hào)分子Src的的磷酸化，P＜0.05，而I127能夠減輕Erk1/2和Src的磷酸化，P＜0.05，酚妥拉明和美托絡(luò)

9、爾則沒(méi)有類似作用，P＞0.05。
　　 (4)信號(hào)調(diào)控機(jī)制研究發(fā)現(xiàn)：基因沉默beta-arrestin2后，EPCs對(duì)VEGF的敏感性顯著地增加(33.7±6.4％VS2.1±1.4％，P＜0.05)，而EPCs對(duì)NE的敏感性顯著地減少(26.6±7.8％VS64.0±13.5％，P＜0.05)?；虺聊琤eta-arrestin2后，EPCs的遷移能力下降，對(duì)NE的敏感性下降。
　　 結(jié)論:NE促進(jìn)肢體缺血時(shí)骨髓EPC