去甲腎上腺素通過toll樣受體4促進巨噬細胞炎癥因子的分泌.pdf

1、應(yīng)激相關(guān)激素去甲腎上腺素(NE)對機體免疫功能的影響已受到學(xué)者們的廣泛關(guān)注。以往研究結(jié)果提示,NE能促進或加劇內(nèi)毒素休克、過敏性疾病、慢性炎癥性疾病以及腫瘤等,但對其作用機制尚不很清楚。長期反復(fù)應(yīng)激導(dǎo)致NE釋放從而致使機體炎癥和免疫功能發(fā)生改變,甚而影響到個體健康狀態(tài)的研究,對其進行研究具有重要的理論和實踐意義。 眾所周知,巨噬細胞廣泛分布于機體全身,被刺激后能釋放種類繁雜的細胞因子等物質(zhì),參與調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)功能。除分泌炎癥因子等

2、之外,巨噬細胞在某些刺激物如LPS等作用下會合成分泌相當數(shù)量的神經(jīng)肽類物質(zhì)以及NE等。與此同時,交感神經(jīng)末梢細密的分布在全身各個臟器,而且在那些存在相當數(shù)量巨噬細胞的免疫器官中,也廣泛分布有交感神經(jīng)末梢。如淋巴結(jié)、脾臟和胸腺等免疫器官,交感神經(jīng)末梢極其豐富,甚至存在著類似于“突觸”樣的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ),而且在免疫系統(tǒng),巨噬細胞、樹突狀細胞和淋巴細胞等都有NE受體表達,這些結(jié)構(gòu)可能為其在局部發(fā)揮作用提供結(jié)構(gòu)基礎(chǔ),也提示交感神經(jīng)系統(tǒng)與免疫系統(tǒng)間相互

3、作用的緊密性和直接性。除下丘腦-垂體-腎上腺皮質(zhì)軸外,交感神經(jīng)系統(tǒng)是另一個重要的應(yīng)激反應(yīng)系統(tǒng)。在應(yīng)激時交感神經(jīng)末梢興奮,其釋放的NE是血液中NE的主要來源。無論是交感神經(jīng)釋放NE,還是自身受到LPS刺激后分泌NE,巨噬細胞很容易處身于一個富于NE的微環(huán)境。近年來,模式識別受體TLR受到免疫學(xué)家的高度重視,被認為是連接天然免疫和獲得性免疫的橋梁。有文獻報道,NE能夠調(diào)節(jié)心血管細胞的氧化應(yīng)激,而活性氧(ROS)參與調(diào)節(jié)toll樣受體4(TL

4、R4)表達。那么,NE能否調(diào)節(jié)TLR4呢?NE是否可能通過調(diào)節(jié)巨噬細胞氧化應(yīng)激進而調(diào)節(jié)TLR4?為此,我們設(shè)計并進行了以下實驗： (1)從整體水平,檢驗NE是否能夠調(diào)節(jié)模式識別受體TLR4的表達。應(yīng)用束縛應(yīng)激模型,通過免疫組化觀察模型小鼠脾臟TLR4表達變化,并觀察束縛應(yīng)激小鼠LPS所致休克后72 h存活率。 (2)Western blot及Quantitative real time PCR技術(shù)檢測NE對體外巨噬細胞T

5、LR4表達的影響。 (3)Western blot檢驗ROS是否能夠調(diào)節(jié)TLR4表達。觀察不同劑量的活性氧對TLR4表達的調(diào)節(jié)作用,應(yīng)用細胞色素C還原法及活性氧熒光探針法檢測NE是否能夠影響巨噬細胞氧化應(yīng)激狀態(tài)。 (4)NE或ROS處理過的巨噬細胞,ELISA檢測在LPS刺激下TNFα變化,化學(xué)發(fā)光法檢測NO生成變化。 (5)探討NE調(diào)節(jié)巨噬細胞氧化應(yīng)激狀態(tài)的具體機制,Westem blot檢測NE可能是通過影響

6、PKC進而影響NADPH氧化酶等。 主要結(jié)果如下： (1)免疫組化結(jié)果發(fā)現(xiàn)慢性束縛應(yīng)激后的模型小鼠脾臟組織TLR4表達增高,與注射6-OHDA后束縛應(yīng)激小鼠相比,TLR4表達量也顯著增加。 (2)NE能夠促進體外巨噬細胞TLR4表達。不同劑量的NE處理巨噬細胞12 h和24 h后,小鼠巨噬細胞TLR4蛋白表達量及mRNA轉(zhuǎn)錄顯著增加,β受體阻斷劑Propranolol及α受體阻斷劑Phtentolamine都能部

7、分阻斷其上述作用,還原劑N乙酰半胱氨酸能部分阻斷NE對TLR4表達的促進作用。 (3)NE能夠促進巨噬細胞產(chǎn)生ROS,后者能夠調(diào)節(jié)TLR4。不同劑量的NE能夠促進巨噬細胞產(chǎn)生ROS,而且具有劑量依賴性。ROS調(diào)節(jié)TLR4表達具有雙向性。高劑量(>100μM)的H2O2抑制TLR4表達,而較低劑量(10μM)則促進TLR4表達。 (4)NE或者H2O2處理巨噬細胞24 h后,再用LPS刺激巨噬細胞后產(chǎn)生的TNFα和NO比L