口腔細(xì)菌影響綠膿假單胞菌感染肺上皮細(xì)胞的體外研究.pdf

1、目的： 牙周病是人類最常見的慢性感染性疾病。近年來，許多國內(nèi)外的專家研究證實(shí)牙周感染可能是引發(fā)全身系統(tǒng)疾病(如：心血管疾病、糖尿病，呼吸系統(tǒng)疾病、消化道疾病、骨質(zhì)疏松、低體重早產(chǎn)兒、皰疹病毒感染等)的危險(xiǎn)因素[1—8]。 牙周病與肺感染的關(guān)系也逐漸進(jìn)入了國內(nèi)外研究者的視野。Bartlet[9]研究發(fā)現(xiàn)35％的院內(nèi)感染的肺炎與致病的厭氧菌有關(guān)。此后大量實(shí)驗(yàn)從感染的肺臟中分離出與牙周破壞有關(guān)的厭氧菌，從而證實(shí)了他的觀點(diǎn)。19

2、90年Slots[10]從難治性牙周炎患者口腔分離出綠膿假單胞菌。國內(nèi)學(xué)者何禮賢[11]通過分子生物學(xué)技術(shù)證實(shí)了獲得性肺炎的病原菌與口咽部細(xì)菌有高度的同源性。上述研究都表明了牙周細(xì)菌與肺感染有著密切的關(guān)系。綠膿假單胞菌是一種很重要的條件性的細(xì)菌性病原體，它可以造成肺部組織和其它全身系統(tǒng)的易感宿主細(xì)胞的感染。綠膿假單胞菌的感染可以通過對上皮細(xì)胞的粘膜黏附和侵入得以實(shí)現(xiàn)。宿主細(xì)胞防御的失敗以至不能清除粘膜表面的綠膿假單胞菌，造成綠膿假單胞菌

3、在局部的增殖，有時(shí)將伴隨著明顯的感染和組織細(xì)胞的大量破壞。本研究通過建立口腔細(xì)菌侵入和感染肺上皮細(xì)胞的體外模型，研究口腔細(xì)菌在綠膿假單胞菌侵入肺上皮細(xì)胞時(shí)的調(diào)節(jié)機(jī)制。目前被確認(rèn)的牙周可疑致病菌主要包括牙齦卟啉單胞菌(Porphyromonas gingivalis，Pg)、具核梭桿菌(Fusobacterium nucleatum，F(xiàn)n)、伴放線菌聚集菌(Aggregatibacter actinomycetemcomitans，Aa)

4、可以顯著增加綠膿假單胞菌進(jìn)入肺上皮細(xì)胞細(xì)菌的數(shù)量。然而，不屬于牙周可疑致病菌的口腔內(nèi)源共生細(xì)菌如內(nèi)氏放線菌(Actinomyces naeslundii，An)和格氏鏈球菌(Streptococcus gordonii，Sg)顯示在綠膿假單胞菌侵入肺上皮細(xì)胞時(shí)沒有明顯促進(jìn)感染的作用。當(dāng)綠膿假單胞菌和口腔細(xì)菌同時(shí)侵入與綠膿假單胞菌單獨(dú)侵入肺上皮細(xì)胞相比，前者將刺激肺上皮細(xì)胞產(chǎn)生更多的炎癥細(xì)胞因子。在口腔的感染細(xì)菌中，牙齦卟啉單胞菌為慢性牙

5、周炎的主要致病菌，在本研究中牙齦卟啉單胞菌與綠膿假單胞菌共同作用于肺上皮細(xì)胞產(chǎn)生炎癥細(xì)胞因子IL—6和IL—8，IL—6激活了JAK—STAT3的信號傳導(dǎo)途徑。STAT3靶基因產(chǎn)物包括影響細(xì)胞凋亡的Bcl—2家族成員和IAP家族中的Survivin抑凋亡蛋白。當(dāng)牙齦卟啉單胞菌細(xì)菌的濃度達(dá)到一定量的時(shí)候，促進(jìn)凋亡蛋白和抑制凋亡蛋白，在不同時(shí)間點(diǎn)的mRNA水平發(fā)生改變，以此推斷出牙齦卟啉單胞菌在短時(shí)間黏附、內(nèi)化于肺上皮細(xì)胞，并在細(xì)胞內(nèi)增殖，

6、與綠膿假單胞菌共同作用更進(jìn)一步的促進(jìn)肺上皮細(xì)胞的凋亡，進(jìn)而導(dǎo)致肺部組織炎癥破壞加重。 本研究的目的是研究當(dāng)口腔細(xì)菌與綠膿假單胞菌共同作用于肺上皮細(xì)胞，細(xì)菌侵入宿主細(xì)胞數(shù)量的變化，誘導(dǎo)宿主細(xì)胞凋亡的程度，闡明這種反應(yīng)的凋亡通路及其細(xì)胞所釋放的細(xì)胞因子在反應(yīng)過程中的動(dòng)態(tài)變化，探討牙周致病菌在導(dǎo)致肺部感染中的協(xié)同作用和作用機(jī)制。 方法： 一、研究對象 呼吸道細(xì)菌：綠膿假單胞菌(Pseudomonas aerug

7、innosa Pa，ATCC BAA—47 PAO1模式株。) 口腔細(xì)菌： ①牙齦卟啉單胞菌(Porphyromonas gingivalis Pg，381模式株) ②具核梭桿菌(Fusobacterium nucleatum Fn，ATCC25586模式株) ⑨伴放線菌聚集菌(Aggregatibacter actinomycetemcomitans Aa，ATCC43717模式株) ④內(nèi)氏放線

8、菌(Actinomycesnaeslundii An，PK606模式株) ⑤格氏鏈球菌(Streptococcus gordonii Sg，Chalis CH1模式株) 呼吸道上皮細(xì)胞：HEp—2細(xì)胞株(人喉表皮癌細(xì)胞株) A549細(xì)胞株(人肺腺癌細(xì)胞株) 二、研究方法 1、細(xì)菌黏附與侵入實(shí)驗(yàn) 包括細(xì)菌和肺上皮細(xì)胞的體外培養(yǎng)，細(xì)菌濃度的選擇與作用時(shí)間的選擇，綠膿假單胞菌單獨(dú)或和其它細(xì)菌共

9、同黏附和侵入肺上皮細(xì)胞時(shí)細(xì)菌與細(xì)胞的數(shù)量變化。 2、細(xì)胞的存活及凋亡細(xì)胞的檢測 (1) MMT法檢測細(xì)菌感染細(xì)胞后，不同時(shí)間段的肺上皮細(xì)胞的活細(xì)胞數(shù)。 (2)熒光分光光度計(jì)分析AMC熒光強(qiáng)度的大小，測定細(xì)胞凋亡蛋白(caspase—3)的活性，反映細(xì)胞凋亡的程度。 3、細(xì)胞因子的檢測： 應(yīng)用酶標(biāo)記免疫吸附實(shí)驗(yàn)方法(ELISA)檢測口腔細(xì)菌對PAO1菌株感染后肺上皮細(xì)胞產(chǎn)生IL—6和IL—8的變化。

10、 4、凋亡蛋白和信號傳導(dǎo)通路蛋白表達(dá)從分子水平 觀察牙齦卟啉單胞菌p.gingivalis381菌株與綠假單胞菌PAO1細(xì)胞株致肺細(xì)胞凋亡的通路及其參與上述過程的細(xì)胞因子，選用RT-PCR和Realtime-PCR研究方法 三、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。對于數(shù)據(jù)呈正態(tài)分布時(shí)，均數(shù)用mean±SD表示，兩組比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)或方差分析。數(shù)據(jù)呈非正態(tài)分布時(shí)，均數(shù)用中位數(shù)表示，組間

11、比較時(shí)應(yīng)用秩和檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料比較使用X2檢驗(yàn)。運(yùn)用Logistic回歸模型進(jìn)行多因素分析。以p<0.05為有顯著差異。 結(jié)論： 1、PAO1與口腔細(xì)菌共同作用于肺上皮細(xì)胞時(shí)，口腔細(xì)菌促進(jìn)PAO1對宿主細(xì)胞的黏附能力都未被明顯增強(qiáng)。反而，p.gingivalis和A．a(chǎn)ctinomycetemcomitans還減少了PAO1的黏附細(xì)胞的能力。對于p.gingivalis、F．nucleatum、A。actinomycete

12、mcomitans等牙周致病菌能夠使侵入肺上皮細(xì)胞的綠膿假單胞菌細(xì)菌的數(shù)量增加1—3倍。相反，A．naeslundii和S．gordonii等牙周非致病性細(xì)菌對綠膿假單胞菌細(xì)菌入侵上皮細(xì)胞沒有明顯影響。檢測細(xì)胞的代謝劑對細(xì)菌侵入的作用，發(fā)現(xiàn)牙周致病菌促進(jìn)綠膿假單胞菌侵入肺上皮細(xì)胞主要是通過調(diào)節(jié)微管、蛋白合成和能量代謝。進(jìn)一步支持不良的口腔衛(wèi)生習(xí)慣與呼吸系統(tǒng)感染有相關(guān)性。 2、牙周致病菌與PAO1一起侵入時(shí)能夠明顯刺激肺上皮細(xì)胞產(chǎn)

13、生更多的細(xì)胞因子的釋放，同時(shí)誘導(dǎo)肺上皮細(xì)胞的細(xì)胞凋亡。提示體內(nèi)條件下由于口腔細(xì)菌侵入呼吸道上皮粘膜表面并隨后誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和細(xì)胞因子釋放可能改變局部的微環(huán)境，促進(jìn)宿主體內(nèi)呼吸系統(tǒng)感染的發(fā)生和發(fā)展。 3、牙齦卟啉單胞菌與綠膿假單胞菌共同作用于肺上皮細(xì)胞，當(dāng)牙齦卟啉單胞菌的濃度達(dá)到一定量的時(shí)候，進(jìn)而激活肺上皮細(xì)胞的JAK/STAT3傳導(dǎo)途徑，來調(diào)節(jié)STAT3的下游的Bcl—2家族和Survivin的蛋白，表現(xiàn)為牙齦卟啉單胞菌可在一段時(shí)