水稻W(wǎng)RKY68在Xa21介導(dǎo)的抗病途徑中的功能研究.pdf

1、背景:世界上近一半的人口以稻米為食。白葉枯病是侵染水稻(Oryza sativa L.)最為嚴(yán)重的細(xì)菌性病害，最早克隆的水稻抗白葉枯病基因Xa21具有廣譜抗性，WRKY作為植物中最大的轉(zhuǎn)錄因子家族之一，在植物生長(zhǎng)發(fā)育和物質(zhì)代謝、應(yīng)對(duì)生物及非生物逆境脅迫、氧化衰老的調(diào)控等過程中起著重要的作用，因此研究WRKY轉(zhuǎn)錄因子在Xa21介導(dǎo)的水稻抗白葉枯病途徑中的作用具有重大意義。
　　目的:利用制備的水稻W(wǎng)RKY68的特異抗體，調(diào)查OsWR

2、KY68在水稻抗白葉枯病過程和各個(gè)生長(zhǎng)發(fā)育時(shí)期的表達(dá)模式;通過體外表達(dá)的WRKY68蛋白質(zhì)，分析其與Xa21介導(dǎo)的抗病途徑中上調(diào)的病程相關(guān)基因啟動(dòng)子調(diào)控區(qū)W-box的結(jié)合特性;構(gòu)建OsWRKY68基因的RNAi載體，獲得基因沉默的轉(zhuǎn)基因植株，從遺傳學(xué)角度系統(tǒng)分析水稻W(wǎng)RKY68轉(zhuǎn)錄因子的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)特征，了解其在Xa21介導(dǎo)的水稻抗白葉枯病途徑中的功能。
　　材料與方法:根據(jù)水稻W(wǎng)RKY68的序列，利用軟件預(yù)測(cè)抗原決定簇，人工合成多

3、肽免疫新西蘭大白兔，制備WRKY68蛋白質(zhì)的多克隆抗體。采用Western blotting(WB)技術(shù)檢測(cè)WRKY68蛋白質(zhì)在水稻接種白葉枯病菌后及正常生長(zhǎng)發(fā)育過程中的表達(dá)特征。利用微量熱泳動(dòng)（Microscale thermophoresis，MST）技術(shù)檢測(cè)WRKY68蛋白質(zhì)與病程相關(guān)基因中順式元件W-box的親和力。根據(jù)WRKY68的LOC號(hào)從水稻基因組注釋數(shù)據(jù)庫(kù)、MPSS(Massively parallel signatur

4、e sequencing)網(wǎng)站和RiceXPro（Rice gene coexpression database）網(wǎng)站下載轉(zhuǎn)錄數(shù)據(jù)。用SMART軟件對(duì)WRKY68蛋白質(zhì)進(jìn)行結(jié)構(gòu)域分析。構(gòu)建WRKY68基因的RNAi載體，以水稻4021為受體進(jìn)行轉(zhuǎn)化。
　　結(jié)果:在水稻接種白葉枯病菌后經(jīng)WB技術(shù)檢測(cè)出現(xiàn)2條帶，其中一條帶約為32kDa，和預(yù)測(cè)分子量相符，其信號(hào)強(qiáng)度比較穩(wěn)定，另外一條帶分子量稍大（標(biāo)注為WRKY68+），在接種后3天被

5、誘導(dǎo)表達(dá)，隨后表達(dá)量呈現(xiàn)上升的趨勢(shì);為進(jìn)一步了解WRKY68蛋白質(zhì)在水稻與Xoo互作中的表達(dá)特征，選取水稻接種后0h、3d和5d的葉片，檢測(cè)了WRKY68蛋白質(zhì)在抗、感和對(duì)照反應(yīng)中的表達(dá)豐度，發(fā)現(xiàn)其表達(dá)譜相似，均在接種后期出現(xiàn)分子量較大的誘導(dǎo)條帶，但在Mock中均未檢測(cè)到。MST結(jié)果顯示W(wǎng)RKY68與PR1b的探針W-1b的解離常數(shù)為25nM，當(dāng)把W-box的核心序列由TGAC突變?yōu)镃CTA后，其解離常數(shù)為353nM，WRKY68與PR

6、10a的探針W-10a和mW-10a的解離常數(shù)分別為33nM和39nM，WRKY68與探針W-1a和BS65及其突變形式都不結(jié)合，上述結(jié)果說明WRKY68與PR1b的W-box特異結(jié)合，與PR10a的W-box結(jié)合是非特異性的，與PR1a不結(jié)合。在水稻不同生育期的葉片中，WRKY68穩(wěn)定表達(dá)，分子量大小與預(yù)期相符。轉(zhuǎn)錄數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)WRKY68在葉片、花序、花藥、雌蕊、種子和胚等組織中均有轉(zhuǎn)錄，在雌蕊中的轉(zhuǎn)錄水平略高;在水稻接種Xoo后，

7、WRKY68在抗病和感病反應(yīng)中的轉(zhuǎn)錄水平略有下降，但在稻瘟病菌侵染后對(duì)WRKY68的轉(zhuǎn)錄影響不大;14天幼苗受冷、干旱和鹽脅迫后，葉片中WRKY68轉(zhuǎn)錄上調(diào);水稻受ABA處理后根中WRKY68的轉(zhuǎn)錄水平提高。構(gòu)建了WRKY68基因的RNAi載體，獲得了轉(zhuǎn)基因植株。
　　結(jié)論:水稻接種Xoo后出現(xiàn)的誘導(dǎo)條帶以及WRKY68與W-box探針的結(jié)合，表明WRKY68在Xa21介導(dǎo)的水稻抵抗白葉枯病的途徑中發(fā)揮作用，這種調(diào)控作用很可能是通