鋅離子在HDAC6介導(dǎo)的tau蛋白經(jīng)自噬—溶酶體途徑降解中的作用研究.pdf

1、異常蛋白聚集是神經(jīng)退行性疾病的一個(gè)重要病理性標(biāo)志，探究細(xì)胞內(nèi)異常蛋白聚集的降解機(jī)制對(duì)于治療神經(jīng)退行性疾病有重要的臨床意義。阿爾茨海默病等tau相關(guān)的神經(jīng)退行性疾病常表現(xiàn)為微管相關(guān)蛋白tau的異常聚集以及異常翻譯后修飾等，該病理特征的產(chǎn)生與細(xì)胞內(nèi)的蛋白降解系統(tǒng)的功能障礙直接相關(guān)。Tau蛋白既是泛素-蛋白酶體系統(tǒng)又是自噬-溶酶體系統(tǒng)的降解底物，在tau相關(guān)疾病中，蛋白酶體的活性明顯下降。當(dāng)?shù)鞍酌阁w發(fā)生功能障礙時(shí)，組蛋白去乙酰化酶6(Hist

2、onedeacetylase6，HDAC6)可與泛素化修飾的錯(cuò)誤折疊蛋白及動(dòng)力蛋白結(jié)合形成復(fù)合物，并將這些泛素化修飾的蛋白沿微管運(yùn)輸?shù)轿⒐芙M織中心形成功能性聚集體(aggresome)結(jié)構(gòu)，最終通過自噬-溶酶體進(jìn)行降解。HDAC6的鋅指結(jié)構(gòu)域包含3個(gè)鋅離子的結(jié)合位點(diǎn)，該結(jié)構(gòu)域介導(dǎo)了HDAC6與泛素化蛋白的結(jié)合，且鋅離子參與了兩者結(jié)合過程的調(diào)節(jié)。鋅離子缺乏能夠?qū)е屡c學(xué)習(xí)記憶相關(guān)的神經(jīng)病變的發(fā)生，如阻礙神經(jīng)元遷移，突觸發(fā)生和突觸傳遞等。然而

3、，目前關(guān)于鋅離子異常在神經(jīng)退行性疾病中的作用和相關(guān)的分子機(jī)制尚不明確。為了探討在tau相關(guān)的神經(jīng)退行性疾病中，鋅離子異常對(duì)tau蛋白降解的作用和機(jī)制，本研究選取HEK293/tau441細(xì)胞為模型，用蛋白酶體活性抑制劑MG132處理細(xì)胞阻斷tau蛋白經(jīng)泛素-蛋白酶體途徑的降解，誘導(dǎo)tau蛋白的泛素化修飾，研究鋅離子含量異常對(duì)HDAC6介導(dǎo)的tau蛋白經(jīng)自噬-溶酶體途徑降解的作用。
　　方法:用MG132(2μM)預(yù)處理HEK293

4、/tau441細(xì)胞2hr后，添加鋅離子螯合劑TPEN(2μM)處理細(xì)胞6hr，誘導(dǎo)鋅離子缺乏，并在添加TPEN(2μM)的基礎(chǔ)上補(bǔ)充外源性鋅離子(5μMZnSO4)處理細(xì)胞6hr探索逆轉(zhuǎn)效應(yīng)。使用免疫印跡技術(shù)檢測細(xì)胞內(nèi)總tau蛋白，自噬體激活標(biāo)志物L(fēng)C3以及HDAC6的含量變化，同時(shí)使用HDAC活性試劑盒檢測HDAC6的活性改變，探討鋅離子含量改變對(duì)HDAC6含量和活性的影響，以及tau蛋白經(jīng)自噬-溶酶體途徑的降解變化;此外使用免疫熒光

5、技術(shù)檢測tau蛋白功能性聚集體形成的改變，使用免疫沉淀方法檢測HDAC6與tau蛋白之間結(jié)合力的改變，探討鋅離子在HDAC6介導(dǎo)的tau蛋白功能性聚集體形成過程中的作用機(jī)制。結(jié)果表明:(1)與對(duì)照組相比，蛋白酶體活性抑制導(dǎo)致tau蛋白含量增加(p＜0.01)，自噬體被激活;與MG132組相比，鋅離子缺乏導(dǎo)致tau蛋白的含量顯著增加(p＜0.01)，自噬標(biāo)志物L(fēng)C3的表達(dá)顯著下調(diào)(p＜0.01);與MG132+TPEN組相比，添加外源性鋅

6、離子能夠逆轉(zhuǎn)TPEN誘導(dǎo)的tau蛋白含量和自噬體活性的改變;(2)與對(duì)照組相比，蛋白酶體活性抑制可以上調(diào)HDAC6的活性(p＜0.01)和含量(p＜0.01);與MG132組相比，鋅離子缺乏下調(diào)HDAC6的活性(p＜0.001)，與MG132+TPEN組相比，添加外源性鋅離子能夠緩解TPEN誘導(dǎo)的HDAC6活性下調(diào)，但與MG132組相比HDAC6的活性依然呈下調(diào)狀態(tài)(p＜0.01)，而與MG132組相比，鋅離子含量的改變對(duì)HDAC6的含

7、量并無明顯改變;(3)與對(duì)照組相比，蛋白酶體活性抑制誘導(dǎo)tau蛋白功能性聚集體的形成;與MG132組相比，鋅離子缺乏導(dǎo)致tau蛋白功能性聚集體形成受阻;與MG132+TPEN組相比，補(bǔ)充外源性鋅離子可促進(jìn)tau蛋白功能性聚集體的形成;(4)與對(duì)照組相比，蛋白酶體活性抑制導(dǎo)致HDAC6與tau蛋白之間結(jié)合增強(qiáng);與MG132組相比，鋅離子缺乏使得HDAC6與tau蛋白之間結(jié)合減弱;與MG132+TPEN組相比，補(bǔ)充外源性鋅離子使得HDAC6