菊芋果聚糖合成酶基因克隆與表達(dá)分析.pdf

菊芋(Helianthus tuberosusL.)，屬菊科向日葵屬，又名洋姜、鬼子姜，是一種多年宿根性草本植物，菊芋高1-3米，有塊狀的地下莖及纖維狀根。菊芋抗逆性好，果聚糖含量高。因此從菊芋中發(fā)掘果聚糖合成酶基因以及對(duì)其功能的分析對(duì)菊芋的耐旱機(jī)理研究和耐旱遺傳改良具有重要意義。本實(shí)驗(yàn)以菊芋品種“青芋1號(hào)”為材料，分別克隆了果聚糖合成酶基因1-SST和1-FFT，通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR對(duì)這兩個(gè)基因在不同程度干旱脅迫處理下的表達(dá)進(jìn)行研究，并對(duì)1-SST和1-FFT進(jìn)行原核表達(dá)，為下一步的轉(zhuǎn)基因奠定了基礎(chǔ)。具體結(jié)果如下：
　　1-SST基因CDS長(zhǎng)1985bp，編碼659個(gè)氨基酸，分子量為74.59kD，等電點(diǎn)為5.10，蛋白質(zhì)半衰期為7.2小時(shí)，為穩(wěn)定性蛋白，總平均親水性為-0.171，屬于親水性蛋白。序列同源性比對(duì)表明，菊芋1-SST與朝鮮薊、萵苣和菜薊等菊科作物的同源性分別為84％、83％、83％。進(jìn)化樹(shù)分析結(jié)果表明菊芋1-SST與朝鮮薊1-SST遺傳距離最近。
　　1-FFT基因CDS長(zhǎng)2025bp，編碼641個(gè)氨基酸，分子量為73.802kD，等電點(diǎn)為10.01，不穩(wěn)定系數(shù)為46.08，屬于不穩(wěn)定蛋白，總平均親水性為-0.153表明1-FFT蛋白屬于親水性蛋白。序列同源性比對(duì)表明表明，菊芋1-FFT與維氏菊的同源性最高，為85％，進(jìn)化樹(shù)分析顯示菊芋1-FFT與維氏菊1-FFT遺傳距離最近。
　　實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果顯示：1-SST和1-FFT在菊芋葉片、莖段、根、花及塊莖中均有表達(dá)，但在不同組織中的表達(dá)水平有顯著差異，1-SST和1-FFT基因在塊莖中的表達(dá)量最高。利用PEG6000模擬脅迫，結(jié)果表明，1-SST基因和在1-FFT基因不同脅迫時(shí)間均有表達(dá)，并存在顯著性差異，其中1-SST基因在48h時(shí)表達(dá)量最高，1-FFT基因在60h時(shí)表達(dá)量最高。
　　以pET30a為原核表達(dá)載體,分別與1-SST和1-FFT基因重組構(gòu)建了融合表達(dá)載體，轉(zhuǎn)入大腸桿菌，進(jìn)行誘導(dǎo)融合蛋白表達(dá)，結(jié)果表明1-SST和1-FFT均能在原核表達(dá)體系中正常表達(dá)。