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文檔簡介
1、研究背景
嚴重燒傷所造成的急性創(chuàng)面對于人民生命健康的威脅一直是我們非常關注的問題。與此同時,隨著社會進步和生產(chǎn)力提高,導致人民生活水平提高、壽命延長,相應出現(xiàn)的慢性創(chuàng)面如糖尿病足、壓瘡等患者明顯增加。無論是急性創(chuàng)面患者還是慢性創(chuàng)面患者,傷口局部或多或少地都會存在壞死組織及其分解物。而在大面積深度燒傷、嚴重電擊傷、肢體擠壓傷或嚴重糖尿病足患者中,機體會產(chǎn)生更加大量的壞死物質。過去人們對創(chuàng)面的認識是一個逐步加深的過程。由于創(chuàng)面
2、的存在,導致機體體液丟失,引起一系列的病理生理變化,所出現(xiàn)的休克等難題得到高度重視。不斷的體液滲出并在局部聚集,造成身體營養(yǎng)的不良、免疫力的下降、微生物良好的生長環(huán)境,因此有關營養(yǎng)、感染問題也倍受關注。但創(chuàng)面滲出物、壞死物本身對機體的影響卻少有提及。組織壞死物除了作為良好的細菌培養(yǎng)基外,本身是否會對機體產(chǎn)生影響?產(chǎn)生怎樣的影響?何種成分在起主要作用?這些問題目前尚缺乏明確答案。
擬似局部組織壞死組織引起全身性損害的現(xiàn)象在臨
3、床上常??梢砸姷?大面積深度燒傷后,機體會出現(xiàn)SIRS、DIC、甚至MODS。
嚴重災禍(如地震、車禍等)可造成擠壓綜合癥,當患者獲救減壓后,有些傷員在醫(yī)療后送的途中就發(fā)生死亡。過去有人指出系大塊肌肉壞死致血鉀升高所致。但有人曾留意到大塊的肌肉壞死并不一定血鉀升高,可死亡照樣發(fā)生。
氣性壞疽病例中,它除了傷口惡臭外,貧血、低蛋白血癥也是常有的伴隨癥狀,如處理不及時,死亡難以避免。
慢性創(chuàng)面伴有組
4、織濕性壞死時,可以出現(xiàn)惡病質樣改變(消瘦、貧血、低蛋白血癥、甚至腹水等),在嚴重糖尿病足患者中,此現(xiàn)象更為常見,更為明顯。
如上所述的現(xiàn)象里,似乎有這樣一條線索擺在我們面前:大量的、充滿異味的壞死組織—吸收入血后—機體損害—嚴重時危及生命。
何種壞死物會對機體產(chǎn)生損害?既往的研究表明,燒傷后機體可產(chǎn)生“燒傷毒素”,但究其成分,眾說不一:有說是“脂蛋白復合物(LPC)”、或是變性蛋白,有說是“脂質過氧化物(LP
5、O)”,甚至還稱是“中分子物質”、內毒素。但無論如何,大量的實驗證明上述物質都不足以導致迅速的、或難以逆轉的生命損害。真正的損害因素尚不得而知。
大家知道,壞死組織在蛋白酶的作用下可水解成氨基酸,再經(jīng)氨基酸脫羧基作用,產(chǎn)生腐胺、尸胺、吲哚等,其中具有明顯生物毒性的物質以多胺為主,腐胺與尸胺更是擁有劇烈毒性。目前已知腐胺、尸胺既作為一種腐毒堿存在于腐敗物中(含量以腐胺居多),也作為生物體的正常成分而廣泛存在于細胞中,微量情況
6、下,對機體的細胞增生、分化、修復起著促進作用,但當機體局部組織嚴重壞死后,伴隨腐胺和尸胺的大量吸收,并在血中超過某種濃度時,會在體內扮演著怎樣的角色?是否會引發(fā)體內的炎癥介質的升高,導致全身性炎癥反應綜合癥的發(fā)生,造成機體全身性的損害?為探討上述問題,我們分別建立了外源性腐胺、尸胺經(jīng)家兔腹腔吸收模型,并以壞死組織勻漿液、生理鹽水為對照,動態(tài)檢測不同物質誘導機體炎癥因子的濃度變化,分析其對機體炎癥因子影響的異同。結果發(fā)現(xiàn),滅菌處理后的創(chuàng)面
7、壞死組織勻漿液可引起全身性炎癥反應,對機體炎癥因子的誘導時間早于內毒素,并且炎癥因子的高峰值甚于內毒素,這強烈提示創(chuàng)面壞死組織分解物中可能隱藏著某種比單純內毒素更強的刺激因子。雖然外源性腐胺和尸胺都可引起機體炎癥反應,且尸胺導致的炎癥反應更強烈。但是腐胺誘導機體炎癥反應與壞死組織勻漿液所誘導的趨勢較為接近,提示腐胺在壞死組織分解物誘導炎癥反應中可能起著更重要的作用。因此鎖定其中的“主要損害物”為腐胺。我們試圖通過對大鼠給予外源性腐胺進行
8、干預,觀察肝、腎等重要臟器生理功能和組織形態(tài)改變、細胞凋亡情況,了解其對機體的影響和病理生理改變過程,理清局部壞死與全身損害的關系,為臨床開展積極有效的預防和治療提供理論依據(jù)。
研究目的:
1、分別觀察健康SD大鼠在不同濃度的外源性腐胺的干預下,對肝、腎等重要臟器組織、細胞結構和功能的影響;
2、觀察健康SD大鼠在不同濃度的外源性腐胺的誘導下,肝、腎細胞異常凋亡程度和變化規(guī)律;
3
9、、初步了解外源性腐胺作用于機體的毒性表現(xiàn)和可能的致害濃度閾值范圍,進一步揭示局部壞死與全身損害的關系。
材料和方法:
1.實驗動物及分組清潔級健康SD大鼠90只,體質量(200±20)g,雌雄不限,由廣東省醫(yī)學實驗動物中心提供。SD大鼠適應性飼養(yǎng)1周后,隨機分為兩組:正常對照組(N組,n=10),外源性腐胺注射組(P組,n=80)。其中P組設50μg·g-1和25μg·g-1兩種腐胺濃度亞組(P1組,n=40
10、;P2組,n=40),各亞組設腹腔內注射(IP)后24h、48h、72h、96h共4個時相點作為機體肝、腎臟器的觀察時相點。各亞組各時相點均為10只。
2.實驗方法外源性腐胺注射組(P組)大鼠從實驗開始(0h)時分別使用50μg·g-1和25μg·g-1兩種濃度的腐胺混合生理鹽水稀釋液共2ml行大鼠腹腔內注射1次。然后于實驗開始后各時相點每一濃度活殺10只,活殺后即開腹心臟采血,同時摘取肝、腎器官并固定組織標本。而正常對照
11、組(N組)只于大鼠腹腔內注射等量的生理鹽水,注射后24h全部活殺。所有實驗動物分籠喂養(yǎng),飼料進食,活殺前6h禁水、食。
3.檢測指標及方法
3.1觀察實驗大鼠一般情況。實驗期間,連續(xù)觀察并記錄注射后各時間點大鼠的一般情況,包括大鼠活動度、精神狀況、進食、尿量、大小便顏色及氣味,眼白及皮毛染色(有無黃疸),死亡率等。
3.2受檢臟器病理變化。摘取肝、腎器官常規(guī)制作病理切片,HE染色后光鏡下觀察肝、
12、腎器官組織形態(tài)學改變;
3.3生化指標檢測。各組各時相點活殺后分別心臟采血2~3.5ml,置于普通干燥試管內靜置30分鐘,2500r/min離心15分鐘分離血清,-76℃保存。采用全自動生化分析儀測定血清中Cr、BUN、ALT、AST的含量;
3.4DNA原位末端缺口標記技術(TUNEL法)檢測細胞凋亡。大鼠肝、腎組織予4%多聚甲醛固定后常規(guī)制作組織切片,按TUNEL試劑盒說明書要求操作,高倍鏡下觀察凋亡陽性
13、細胞,再通過專業(yè)圖像分析軟件計算肝、腎細胞凋亡率。
4.統(tǒng)計學處理
各組數(shù)據(jù)中,計量資料用均數(shù)±標準差((-x)±s)表示,計數(shù)資料以百分比(%)表示。應用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學處理。本實驗為2×4*4的析因設計,計量資料行完全隨機分組兩因素析因分析(即two-wayanalysisofvariance),了解各變量之間的主效應和交互作用;各時間組、濃度組之間采用單因素方差分析(One-WayAN
14、OVA),然后用Levene'stest檢驗方差是否齊性(檢驗水準α=0.05),如果方差齊則進一步對樣本均數(shù)進行兩兩比較的LSD檢驗,反之,如果方差不齊則采用近似F檢驗的Welch方法進行方差分析后,Dunnett'sT3檢驗進行兩兩比較,假設檢驗為雙側檢驗,檢驗水準α=0.05,P<0.05時差異具有統(tǒng)計學意義。由于計數(shù)資料2×3格表中出現(xiàn)0,將0調整為0.5后行PearsonChi-Square檢驗方法,當p<0.05時,差異具有
15、統(tǒng)計學意義。
結果
(1)P組大鼠注射后出現(xiàn)短暫急性毒性癥狀,其中P1組多數(shù)呈精神抑制改變,P2組多數(shù)呈興奮型改變,P1組和P2組比較,精神狀態(tài)改變存在顯著差異(x2=69.408,p<0.01);
(2)P組大鼠各亞組各時相點肝、腎病理切片HE染色后在光鏡下見肝、腎組織少部分有輕度的水腫,無明顯的細胞壞死;
(3)血清生化指標提示,與N組比較,Cr、BUN、ALT、AST含量于外
16、源性腐胺注射后24h、48h、72h、96h基本呈不同程度升高。P1和P2兩亞組間不同腐胺濃度進行比較,Cr、BUN、AST值均存在顯著差異(F=4.759,P=0.032;F=10.88,P=0.002;F=12.21,P=0.001),其中:Cr、BUN值P2組>P1組,AST值P1組>P2組;P1和P2兩亞組間不同時相點進行比較,Cr、BUN、ALT、AST值也均存在顯著差異(F=14.322,P=0.000;F=15.84,P=
17、0.000;F=3.23,P=0.027;F=8.22,P=0.000);Cr、BUN、ALT、AST四項指標中P1和P2兩亞組間腐胺濃度和時相點交互效應顯著(F=5.314,P=0.003;F=9.441,P=0.000;F=16.582,P=0.000;F=11.811,P=0.000)。與N組比較,實驗組各檢測指標值基本于24h后開始升高,72h后升高明顯,其中Cr、BUN、ALT值于96h后達到峰值(P<0.05)。
18、 (4)采用TUNEL法檢測發(fā)現(xiàn),P1組肝、腎組織中凋亡細胞逐漸增多,96h后達峰值。P1組96h時相點與N組比較,肝細胞凋亡率明顯升高[(15.29±1.41)%vs(3.50±0.30)%,P<0.01],腎細胞凋亡率也明顯升高[(24.78±2.19)%vs(4.47±0.33)%,P<0.01];P2組中肝、腎組織中凋亡細胞于注射后48h即達到峰值,96h后逐漸回落至正常。P2組48h時相點與N組比較,肝細胞凋亡率明顯升高[(
19、13.81±1.66)%vs(3.50±0.30)%,P<0.01]、腎細胞凋亡率也明顯升高[(26.27±2.13)%vs(4.47±0.33)%,P<0.01]。
結論
1一定濃度的外源性腐胺能導致肝、腎等重要臟器功能出現(xiàn)不同程度的損害,但在光鏡下不一定伴有肝、腎組織形態(tài)學上的明顯異常;
2.外源性腐胺可誘導肝、腎細胞高凋亡率,凋亡程度與外源性腐胺存在時間-劑量效應;
3.本實
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