外源性線粒體對(duì)大鼠皮層星形膠質(zhì)細(xì)胞活性及功能的影響.pdf

1、本文從以下幾方面進(jìn)行論述：
　　第一部分：外源性線粒體的提取和功能研究。
　　目的：有研究顯示，細(xì)胞或組織上提取的線粒體可以保持其原有的活性和功能，維持其原有的完整性。同時(shí)也發(fā)現(xiàn)，嚙齒動(dòng)物細(xì)胞系中分離的線粒體可以成功地注射到同源性的卵母細(xì)胞或者單細(xì)胞胚胎中。這里我們用重組質(zhì)粒編碼珊瑚蟲紅色熒光蛋白2與人類細(xì)胞色素C氧化酶中線粒體靶向序列的融合蛋白（Plasmid encodes a fusion of Discosoma s

2、p. Red fluorescent protein and the mitochondrial targeting sequence from subunit VIII of human cytochrome Coxidase，pDsRed2-Mito），用以轉(zhuǎn)染中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞（Chinese Hamster Ovary，CHO），提取特異性標(biāo)記的線粒體，觀察其功能和對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的選擇性。
　　方法：用重組質(zhì)粒pDsRed2-M

3、ito轉(zhuǎn)染并單克隆CHO細(xì)胞，以構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)紅色熒光線粒體的鼠源性細(xì)胞株（Mitochondria-CHO，Mito-CHO）。熒光檢測(cè)線粒體在Mito-CHO細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)情況。另外，組織上提取線粒體，熒光檢測(cè)肝源性線粒體提取后被MitoTracker Deep Red FM標(biāo)記的情況。從Mito-CHO細(xì)胞中分離線粒體，運(yùn)用JC-1（檢測(cè)線粒體膜電位的熒光探針）試劑盒檢測(cè)線粒體提取后的膜電位改變。細(xì)胞熒光觀察不同來源的外源性線粒體進(jìn)入

4、原代培養(yǎng)神經(jīng)細(xì)胞的選擇性。激光共聚焦顯微鏡層掃進(jìn)一步檢測(cè)外源性線粒體進(jìn)入大鼠皮層星形膠質(zhì)細(xì)胞的情況。
　　結(jié)果：細(xì)胞熒光結(jié)果顯示，單克隆并擴(kuò)大培養(yǎng)后的Mito-CHO細(xì)胞株可以完全表達(dá)紅色熒光標(biāo)記的線粒體；而且MitoTracker? Deep Red FM可以標(biāo)記小鼠肝臟線粒體。JC-1法檢測(cè)線粒體提取后的膜電位，發(fā)現(xiàn)線粒體提取后與CHO細(xì)胞（Con：100±12.64％，n=3）中的線粒體膜電位一致（Mito：99.24±5.

5、39%，n=3，p>0.05 vs control），即提取后的線粒體膜電位正常。細(xì)胞熒光觀察發(fā)現(xiàn)，從 Mito-CHO細(xì)胞以及小鼠肝臟上提取的線粒體均可以進(jìn)入大鼠皮層星形膠質(zhì)細(xì)胞。這種作用具有細(xì)胞選擇性，即Mito-CHO細(xì)胞上提取的線粒體僅能進(jìn)入大鼠皮層星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞，而不能進(jìn)入大鼠皮層及海馬神經(jīng)元。激光共聚焦顯微鏡層掃進(jìn)一步觀察外源性線粒體進(jìn)入大鼠皮層星形膠質(zhì)細(xì)胞的情況發(fā)現(xiàn)，外源性線粒體確實(shí)是進(jìn)入到細(xì)胞內(nèi)，而不是附著在胞

6、膜外。
　　結(jié)論：Mito-CHO細(xì)胞中提取的線粒體功能沒有改變。外源性線粒體對(duì)培養(yǎng)的神經(jīng)細(xì)胞具有選擇性，只能進(jìn)入大鼠皮層星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞，而不能進(jìn)入大鼠皮層及海馬神經(jīng)元。
　　第二部分：外源性線粒體對(duì)大鼠皮層星形膠質(zhì)細(xì)胞的作用。
　　目的：線粒體參與星形膠質(zhì)細(xì)胞的ATP供能、離子緩沖、谷氨酸氧化等過程，在神經(jīng)系統(tǒng)疾病如抑郁癥、認(rèn)知、自閉癥和精神分裂癥等中發(fā)揮重要作用。這里我們主要研究外源性給予線粒體后對(duì)星形膠

7、質(zhì)細(xì)胞的活性和功能的影響。
　　方法：熒光檢測(cè)Mito-CHO細(xì)胞上提取的線粒體進(jìn)入大鼠皮層正常星形膠質(zhì)細(xì)胞的濃度和時(shí)間梯度。3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴鹽（3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-Diphenyl-2-H-tetrazolium bromide，MTT）法確定H2O2損傷星形膠質(zhì)細(xì)胞的孵育條件。JC-1法檢測(cè)外源性線粒體對(duì)正常和H2O2損傷的星形膠質(zhì)細(xì)胞膜電位的

8、影響。再用 MTT法檢測(cè)外源性線粒體對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞活性的影響。末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的dUTP缺口末端標(biāo)記（TdT-mediated dUTP Nick-End Labeling，TUNEL）法檢測(cè)外源性線粒體對(duì)正常和H2O2損傷的星形膠質(zhì)細(xì)胞凋亡情況的影響。細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)檢測(cè)外源性線粒體對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞劃痕損傷的保護(hù)作用。
　　結(jié)果：熒光觀察外源性線粒體進(jìn)入正常星形膠質(zhì)細(xì)胞的濃度依賴性發(fā)現(xiàn)，在一定范圍內(nèi)，外源性線粒體給予越多，進(jìn)入

9、細(xì)胞內(nèi)的數(shù)量也就越多，其中1×106個(gè)細(xì)胞給予24μg線粒體孵育24h，大部分外源性線粒體已進(jìn)入星形膠質(zhì)細(xì)胞。MTT法研究發(fā)現(xiàn)，給予400μM H2O2（Con：100±13.40%；400μM：48.95±5.40%，n=5， p<0.01 vs control）以及H2O2孵育1h（Con：100±21.92%；1h：38.97±13.12%，n=7，p<0.05 vs control）顯著損傷星形膠質(zhì)細(xì)胞。JC-1法檢測(cè)外源性線粒

10、體進(jìn)入細(xì)胞后的膜電位改變，發(fā)現(xiàn)正常（Con：100±6.16%；Con+Mito：92.35±2.56%，n=3，p>0.05 vs control）和H2O2損傷（H2O2：78.02±7.36%，n=3，p<0.01 vs control；H2O2+Mito：78.89±13.65%，n=3，p>0.05 vs H2O2）的星形膠質(zhì)細(xì)胞給予外源性線粒體前后的線粒體膜電位均不受影響。通過MTT法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，外源性線粒體對(duì)正常（Con：1

11、00±20.35%；Con+Mito：95.66±28.35%，n=5-6，p>0.05 vs control）和H2O2損傷（H2O2：90.07±18.76%，n=6，p<0.05 vs control；H2O2+Mito：83.94±15.51%，n=6，p>0.05 vs H2O2）的星形膠質(zhì)細(xì)胞的活性無影響；其中與Con組相比，由于與孵育外源性線粒體24h平行操作，導(dǎo)致H2O2組細(xì)胞活性稍有下降，可能因?yàn)榧?xì)胞活性于24h后稍有

12、恢復(fù)。運(yùn)用TUNEL法檢測(cè)外源性線粒體對(duì)正常和損傷星形膠質(zhì)細(xì)胞凋亡情況的影響，發(fā)現(xiàn)外源性線粒體對(duì)正常星形膠質(zhì)細(xì)胞的凋亡情況無影響（Con：100±33.56%；Con+Mito：107.78±15.40%，n=3，p>0.05 vs control），而可以明顯改善H2O2損傷模型的凋亡情況（H2O2：1316.4±115.47%，n=3，p<0.01 vs control；H2O2+Mito：390.48±128.84%，n=3，p<

13、0.01 vs H2O2）。通過細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)研究外源性線粒體對(duì)正常和損傷星形膠質(zhì)細(xì)胞的保護(hù)作用，結(jié)果顯示，劃痕24h后，預(yù)先給予外源性線粒體的星形膠質(zhì)細(xì)胞遷移的細(xì)胞數(shù)（Con：100±8.73%；Mito：157.56±13.89%，n=3，p<0.01 vs control）比未加線粒體的Scratch組遷移的細(xì)胞數(shù)多。
　　結(jié)論：每1×106個(gè)細(xì)胞給予24μg外源性線粒體在37oC、5%CO2中孵育24h，大部分線粒體能進(jìn)入星