外源性HMGB1對Lewis細胞凋亡和增殖的影響.pdf

1、目的:
　　以Lewis肺癌細胞為靶向，探討高遷移率族蛋白B1(high mobility group protein B1，HMGB1)對癌細胞凋亡或增殖作用的影響，了解與其相關(guān)的細胞內(nèi)信號途徑。
　　方法:
　　(1)細胞饑餓的誘導和細胞凋亡的檢測:饑餓緩沖液HBSS刺激Lewis細胞0、4、8、12h后采用Annexin(Ⅴ)/PI流式雙染及Hoechst33342染核檢測其凋亡情況。此外，1μg/ml、10μg

2、/ml外源性HMGB1蛋白作用于饑餓處理6h的Lewis細胞后同法檢測其凋亡率和存活率。
　　(2)促/抗凋亡蛋白的檢測:10μg/ml外源性HMGB1蛋白作用于Lewis細胞0、12、24、36、48h后，在流式分析其凋亡百分比的同時，Western blot檢測促凋亡蛋白Bax及抗凋亡蛋白Bcl-2的表達量。
　　(3)RAGE和TLR-4受體檢測:PCR檢測Lewis細胞HMGB1相關(guān)受體的基因，熒光顯微鏡進一步觀察H

3、MGB1主要受體RAGE和TLR-4在Lewis細胞膜上的表達情況。此外，流式細胞術(shù)分析外源性HMGB1蛋白作用后Lewis細胞RAGE和TLR-4表達量的變化。
　　(4)細胞增殖情況檢測:10μg/ml HMGB1蛋白作用于Lewis細胞后，應(yīng)用MTT和CFSE法檢測細胞增殖情況，同時檢測加入RAGE和TLR-4抗體封閉細胞膜表面受體后細胞的增殖情況。Western blot進一步分析PI3K/Akt及Erk1/2蛋白的表達，

4、并加入10μmol/L Erk1/2抑制劑U-0126后觀察其對Lewis細胞增殖的影響。
　　結(jié)果:
　　(1)饑餓緩沖液HBSS作用于Lewis細胞0、4、8、12h后Annexin(Ⅴ)/PI流式雙染結(jié)果表明，細胞凋亡率隨著時間的增加而逐漸增多;Hoechst33342染核后熒光顯微鏡檢測的結(jié)果顯示，隨著時間的增加細胞體積變小，核碎裂，染色質(zhì)濃縮并且凋亡的細胞數(shù)也增多。1μg/ml、10μg/ml外源性HMGB1蛋白作

5、用于饑餓處理6h的Lewis細胞后，其凋亡率降低、存活率增加并且隨著濃度的加大變化更明顯。
　　(2)10μg/ml外源性HMGB1蛋白作用于未處理的Lewis細胞0、12、24、36、48h后其凋亡百分比降低，同時western blot結(jié)果顯示隨時間的增加促凋亡蛋白Bax表達量減少，而抗凋亡蛋白Bcl-2的表達量呈上升趨勢。
　　(3)PCR結(jié)果表明，Lewis細胞存在HMGB1相關(guān)受體RAGE、TLR-2、TLR-4和

6、TLR-9;免疫熒光顯示，HMGB1主要受體RAGE和TLR-4均表達于Lewis細胞膜上，且加入外源性HMGB1作用后RAGE和TLR-4的表達量升高。
　　(4)MTT和CFSE結(jié)果都表明，10μg/ml外源性HMGB1蛋白能促進Lewis細胞增殖，而RAGE和TLR-4抗體則對細胞增殖有抑制作用。Western blot結(jié)果顯示，PI3K/Akt及Erk1/2蛋白活化，其磷酸化水平呈上升趨勢，而Erk1/2抑制劑U-0126