番茄Sly-miR403的分離鑒定及在番茄發(fā)育過程中的功能研究.pdf

1、microRNA(miRNA)是一類保守的、長度為19~24個堿基的小分子非編碼RNA。在植物中，miRNA通過對靶基因進行剪切、抑制蛋白翻譯因子對靶基因的識別或?qū)Π谢虻幕蚪M進行甲基化等，從而在轉(zhuǎn)錄或轉(zhuǎn)錄后水平特異調(diào)控靶基因的表達。miRNA合成及作用途徑中的重要因子，如AGO蛋白、DCL1及HEN1等在植物的發(fā)育過程中發(fā)揮著重要的作用。AGO2是RNA Induced silencing complex(RISC)的核心元件之一，

2、有研究報道AGO2為miR403的靶基因；然而，在重要的果實模式生物——番茄中，AGO2與miR403的生理功能尚不明確。因此，為了闡明番茄miR403的生理功能，以micro-Tom番茄為研究對象，利用生物信息學(xué)方法和分子生物學(xué)技術(shù)，獲得并驗證番茄miR403序列，通過現(xiàn)代生物技術(shù)手段構(gòu)建表達載體、遺傳轉(zhuǎn)化獲得miR403超表達和缺失表達的轉(zhuǎn)基因植株，觀察其表型并對其靶基因進行分析，得到如下主要研究結(jié)果：
　　1.通過擬南芥 m

3、iR403(MI0001072)成熟序列在番茄 siRNA數(shù)據(jù)庫進行 blast比對，找出潛在的番茄miR403(S14362631)；通過在番茄基因組數(shù)據(jù)庫中進行低閾值對比，找出與番茄miR403匹配的基因組位點，其所在位置即為miR403的潛在前體序列；通過RNA結(jié)構(gòu)軟件分析，確定其是能夠形成完整莖環(huán)結(jié)構(gòu)的Sly-miR403前體序列；
　　2.用番茄miR403成熟序列對比，找出潛在靶基因AGO2，采用5’ RACE map

4、ping技術(shù)檢測AGO2的匹配位點，證實Sly-miR403在番茄中可發(fā)揮作用，能有效剪切AGO2基因的mRNA；同時用定量PCR檢測Sly-miR403及其靶基因在番茄中的表達模式，驗證成熟序列的正確性并分析其在番茄生長發(fā)育中潛在的作用；
　　3.根據(jù)獲得的Sly-pre-miR403序列，設(shè)計基因特異性引物，對Sly-pre-miR403進行擴增，并克隆到植物表達載體 pBi121上，命名為 pBi121-miR403；根據(jù)S

5、ly-miR403的成熟序列，設(shè)計miR403-sponge片段，合成后構(gòu)建到pBi121上，命名為pBi121-miR403-sponge載體；將pBi121-miR403、pBi121-miR403-sponge用凍融法轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌C58中，并用葉盤法轉(zhuǎn)入野生型番茄，獲得其轉(zhuǎn)基因植株；
　　4.通過觀察轉(zhuǎn)基因植株的表型并分析發(fā)現(xiàn)，pBi121-miR403超表達的轉(zhuǎn)基因植株出現(xiàn)開花延遲、葉片異常、種子發(fā)芽過程中對ABA的抗性及頂

6、端分生異常的現(xiàn)象；
　　5.檢測靶基因在轉(zhuǎn)基因及非轉(zhuǎn)基因植株中的表達變化，明確 miR403超表達后降低其靶標(biāo)基因SlAGO2的豐度，同時提高SlAGO1A/SlAGO1B的豐度，從而影響miR156、miR159及miR394等下游miRNA的表達，進而影響番茄的生長發(fā)育。提出了miR403/AGO2、miR168/AGO1在生長發(fā)育、病毒入侵條件下不同的平衡假設(shè)。
　　課題以重要的果實模式生物番茄為研究材料，分離和鑒定