番茄SlAGO7的克隆、鑒定及其功能研究.pdf

1、ARGONAUTE(AGO)蛋白是一類高度保守且龐大的基因家族，作為沉默復(fù)合體的核心成分，在所有已知小RNA介導(dǎo)的沉默調(diào)控途徑中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。反式作用小RNA(ta-siRNA)是植物體內(nèi)特有的一種內(nèi)源小RNA，以剪切降解的方式對其靶標(biāo)基因的mRNA進(jìn)行負(fù)調(diào)控，從而影響植物正常的生長發(fā)育。AGO7蛋白是TAS3 ta-siRNA生物合成途徑中必需的組分，同時TAS3 ta-siRNA的剪切作用活性也完全依賴于它。因此，AGO7蛋白在植

2、物體內(nèi)發(fā)揮的生物學(xué)功能部分是通過ta-siRNA途徑來實(shí)現(xiàn)的。大量研究結(jié)果證實(shí)，ta-siRNA途徑對側(cè)生器官的近軸-遠(yuǎn)軸面的形態(tài)建成具有很重要且保守的調(diào)控作用。但是至今沒有關(guān)于番茄 ta-siRNA途徑中的一些重要基因的分離及其參與葉、花發(fā)育的報道。所以，開展番茄SlAGO7基因的功能研究對深入闡明ta-siRNA途徑在番茄生長發(fā)育過程的調(diào)控機(jī)理具有重要意義。
　　為了研究SlAGO7的生物學(xué)功能，本文以番茄為材料，開展了以下幾

3、個方面的研究：
　　1、根據(jù)番茄基因組數(shù)據(jù)庫中SlAGO7的EST序列信息，利用 RACE和 PCR技術(shù)從番茄花cDNA和葉基因組DNA中分別克隆SlAGO7的cDNA全長序列和基因組 DNA序列，用生物信息學(xué)方法對基因序列特征進(jìn)行分析。結(jié)果顯示：SlAGO7的cNDA全長片段為3238 bp，含有3003 bp的完整開放閱讀框，編碼1000個氨基酸，包含3個外顯子和2個內(nèi)含子。SlAGO7編碼的氨基酸序列含有兩個高度保守的PAZ

4、和PIWI結(jié)構(gòu)域，具有典型的AGO類蛋白的結(jié)構(gòu)特征；與已報道的其他物種的AGO7蛋白的序列具有較高的同源性；SlAGO7基因?qū)儆贏GO蛋白家族中的ZIPPY/AGO7亞家族。
　　2、采用定量PCR方法，對SlAGO7基因進(jìn)行時空表達(dá)模式分析，結(jié)果表明：SlAGO7在營養(yǎng)組織葉中微弱表達(dá)，主要集中在根和莖中表達(dá)；而在生殖器官花中強(qiáng)烈表達(dá)，表達(dá)豐度從花蕾到盛開的花呈遞增趨勢，但在果實(shí)的不同發(fā)育時期中表達(dá)都非常微弱甚至不表達(dá)。為了進(jìn)一

5、步明確 SlAGO7在花中不同部分的表達(dá)特征，以開花當(dāng)天的萼片、花瓣、雄蕊、雌蕊為材料，進(jìn)行PCR定量檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)SlAGO7在萼片中表達(dá)量最高，花瓣與雌蕊種表達(dá)適中，在雄蕊中微弱表達(dá)。這些結(jié)果為推測和研究 SlAGO7在番茄中的潛在生物學(xué)功能提供了一定的線索和思路。
　　3、為了深入研究SlAGO7基因的功能，分別構(gòu)建了SlAGO7基因超表達(dá)載體和反義抑制表達(dá)載體并轉(zhuǎn)化番茄，對SlAGO7超表達(dá)植株進(jìn)行形態(tài)學(xué)特征分析，結(jié)果表明

6、，SlAGO7基因超表達(dá)導(dǎo)致葉片近軸面極性發(fā)育的異常和花形態(tài)的改變；同時，SlAGO7超表達(dá)后改變了 TAS3 ta-siRNA前體及其靶標(biāo)基因的轉(zhuǎn)錄水平，表明SlAGO7基因?qū)Ψ褌?cè)生器官極性形成的調(diào)控是通過ta-siRNA途徑來實(shí)現(xiàn)的。
　　4、SlAGO7超表達(dá)之后，HD-ZIP III類轉(zhuǎn)錄因子SlREV、SlHB15、SlHB8、SlPHV、SlPHB的表達(dá)下調(diào)，同時，參與調(diào)控花器官形成的MADS-box轉(zhuǎn)錄因子SlAP