番茄SlAGO7的克隆、鑒定及其功能研究.pdf

1、ARGONAUTE(AGO)蛋白是一類高度保守且龐大的基因家族，作為沉默復合體的核心成分，在所有已知小RNA介導的沉默調控途徑中發(fā)揮著關鍵作用。反式作用小RNA(ta-siRNA)是植物體內特有的一種內源小RNA，以剪切降解的方式對其靶標基因的mRNA進行負調控，從而影響植物正常的生長發(fā)育。AGO7蛋白是TAS3 ta-siRNA生物合成途徑中必需的組分，同時TAS3 ta-siRNA的剪切作用活性也完全依賴于它。因此，AGO7蛋白在植

2、物體內發(fā)揮的生物學功能部分是通過ta-siRNA途徑來實現的。大量研究結果證實，ta-siRNA途徑對側生器官的近軸-遠軸面的形態(tài)建成具有很重要且保守的調控作用。但是至今沒有關于番茄 ta-siRNA途徑中的一些重要基因的分離及其參與葉、花發(fā)育的報道。所以，開展番茄SlAGO7基因的功能研究對深入闡明ta-siRNA途徑在番茄生長發(fā)育過程的調控機理具有重要意義。
　　為了研究SlAGO7的生物學功能，本文以番茄為材料，開展了以下幾

3、個方面的研究：
　　1、根據番茄基因組數據庫中SlAGO7的EST序列信息，利用 RACE和 PCR技術從番茄花cDNA和葉基因組DNA中分別克隆SlAGO7的cDNA全長序列和基因組 DNA序列，用生物信息學方法對基因序列特征進行分析。結果顯示：SlAGO7的cNDA全長片段為3238 bp，含有3003 bp的完整開放閱讀框，編碼1000個氨基酸，包含3個外顯子和2個內含子。SlAGO7編碼的氨基酸序列含有兩個高度保守的PAZ

4、和PIWI結構域，具有典型的AGO類蛋白的結構特征；與已報道的其他物種的AGO7蛋白的序列具有較高的同源性；SlAGO7基因屬于AGO蛋白家族中的ZIPPY/AGO7亞家族。
　　2、采用定量PCR方法，對SlAGO7基因進行時空表達模式分析，結果表明：SlAGO7在營養(yǎng)組織葉中微弱表達，主要集中在根和莖中表達；而在生殖器官花中強烈表達，表達豐度從花蕾到盛開的花呈遞增趨勢，但在果實的不同發(fā)育時期中表達都非常微弱甚至不表達。為了進一

5、步明確 SlAGO7在花中不同部分的表達特征，以開花當天的萼片、花瓣、雄蕊、雌蕊為材料，進行PCR定量檢測，結果發(fā)現SlAGO7在萼片中表達量最高，花瓣與雌蕊種表達適中，在雄蕊中微弱表達。這些結果為推測和研究 SlAGO7在番茄中的潛在生物學功能提供了一定的線索和思路。
　　3、為了深入研究SlAGO7基因的功能，分別構建了SlAGO7基因超表達載體和反義抑制表達載體并轉化番茄，對SlAGO7超表達植株進行形態(tài)學特征分析，結果表明

6、，SlAGO7基因超表達導致葉片近軸面極性發(fā)育的異常和花形態(tài)的改變；同時，SlAGO7超表達后改變了 TAS3 ta-siRNA前體及其靶標基因的轉錄水平，表明SlAGO7基因對番茄側生器官極性形成的調控是通過ta-siRNA途徑來實現的。
　　4、SlAGO7超表達之后，HD-ZIP III類轉錄因子SlREV、SlHB15、SlHB8、SlPHV、SlPHB的表達下調，同時，參與調控花器官形成的MADS-box轉錄因子SlAP