膠質(zhì)瘤不同病理級別差異miRNA-mRNA動態(tài)表達(dá)譜構(gòu)建及其對接研究.pdf

1、研究背景：
　　 膠質(zhì)瘤是顱內(nèi)最常見的惡性腫瘤，以星形細(xì)胞膠質(zhì)瘤最為多見，其次為膠質(zhì)母細(xì)胞瘤。研究表明，膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展常涉及p53、p16、RB、PTEN、LRRC4等抑癌基因的失活以及c-Myc、HRAS、EGFR、MDM2等基因的過表達(dá)，而這些基因在不同病理級別的膠質(zhì)瘤中具有特定的表達(dá)變化模式，如p53突變與過表達(dá)、MDM2過表達(dá)常發(fā)生于各級別膠質(zhì)瘤，其表達(dá)水平與病理分級之間無明顯關(guān)聯(lián)，然而亦有文獻報道，p53突變與過表達(dá)

2、在高級別膠質(zhì)瘤中表現(xiàn)更為明顯；p16、LRRC4低表達(dá)亦常發(fā)生于各級別膠質(zhì)瘤，且在高級別膠質(zhì)瘤中改變更為明顯；PTEN突變，RB失活，c-Myc、HRAS、EGFR過表達(dá)則發(fā)生于高級別膠質(zhì)瘤。基因表達(dá)受DNA水平、轉(zhuǎn)錄水平、轉(zhuǎn)錄后水平及蛋白水平等多層面的調(diào)控，其中miRNA在轉(zhuǎn)錄后水平對基因表達(dá)的精細(xì)調(diào)控近年來倍受關(guān)注。研究表明，miRNA在細(xì)胞增殖、分化、凋亡以及機體發(fā)育、代謝等基本生命活動過程中發(fā)揮重要作用，miRNA表達(dá)異常與包括

3、膠質(zhì)瘤在內(nèi)的多種腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，miR-21、miR-221、miR-10b等在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中表達(dá)上調(diào)，而原本在正常腦組織中含量豐富的miR-128、miR-181等則表達(dá)下調(diào)。進一步研究表明，這些表達(dá)異常的miRNA在膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展過程中可能發(fā)揮類似癌基因或抑癌基因的作用。然而，對于miRNA在膠質(zhì)瘤不同病理級別中的動態(tài)表達(dá)模式鮮有報道。
　　 基于以上認(rèn)識，本研究同時采用miRNA芯片和全基因組表達(dá)譜芯片探討m

4、iRNA與基因在膠質(zhì)瘤不同病理級別中的表達(dá)變化規(guī)律，構(gòu)建膠質(zhì)瘤不同病理級別差異miRNA/mRNA動態(tài)表達(dá)譜，并對篩選的差異miRNA/mRNA進行了對接研究。
　　 膠質(zhì)瘤不同病理級別差異miRNA動態(tài)表達(dá)譜構(gòu)建
　　 采用miRNA芯片分析了3例正常腦組織及13例星形細(xì)胞膠質(zhì)瘤組織(Ⅰ級3例、Ⅱ級5例、Ⅲ級5例)中637種miRNA的表達(dá)情況，結(jié)合非參數(shù)檢驗、方差分析以及t檢驗獲得不同病理級別膠質(zhì)瘤的差異miRNA。

5、我們對這些差異miRNA在各級別膠質(zhì)瘤中的表達(dá)變化規(guī)律進行了總結(jié)分析，結(jié)果顯示，差異miRNA在不同病理級別膠質(zhì)瘤中的表達(dá)模式大致分為8類。其中miR-26a在各級別膠質(zhì)瘤中均表達(dá)上調(diào)，尤其以在膠質(zhì)瘤Ⅲ級中表達(dá)上調(diào)最為明顯，而miR-21、miR-23a則主要在膠質(zhì)瘤Ⅲ級中表達(dá)上調(diào)，這些提示miR-26a可能與膠質(zhì)瘤的發(fā)生及惡性進展相關(guān)，而miR-21、miR-23a則主要與膠質(zhì)瘤的惡性進展相關(guān)；此外，miR-107、miR-124、m

6、iR-128a/128b、miR-138、miR-149、miR-181a、miR-181b、miR-302b在各級別膠質(zhì)瘤中均表達(dá)顯著下調(diào)，提示這些差異miRNA與膠質(zhì)瘤的發(fā)生密切相關(guān)。由此可見，miRNA在不同病理級別膠質(zhì)瘤中的表達(dá)并不是單一的上調(diào)或下調(diào)，它們存在各自特定的表達(dá)變化模式，以此構(gòu)成膠質(zhì)瘤不同病理級別特定的差異miRNA表達(dá)譜。
　　 部分差異miRNA在不同病理級別膠質(zhì)瘤中動態(tài)表達(dá)模式的驗證
　　 應(yīng)用

7、Real-time PCR對miR-107、miR-124、miR-138、miR-149、miR-302b、miR-23a在6例正常腦組織及50例膠質(zhì)瘤組織(Ⅰ級6例、Ⅱ級20例、Ⅲ級9例、Ⅳ級15例)中進行了驗證，證實miR-107、miR-124、miR-138、miR-149在各級別膠質(zhì)瘤中表達(dá)均顯著下調(diào)，且其表達(dá)水平與病理分級負(fù)相關(guān)，該驗證結(jié)果與芯片結(jié)果相符。miR-23a則在膠質(zhì)瘤Ⅱ、Ⅲ級中表達(dá)逐漸上調(diào)，以在膠質(zhì)瘤Ⅲ級中表達(dá)

8、水平最高，與芯片結(jié)果相符，但在膠質(zhì)瘤Ⅳ級中幾乎檢測不到表達(dá)。隨后我們應(yīng)用miR-23a寡核苷酸探針在同一批組織樣本中進行了原位雜交驗證，結(jié)果顯示，miR-23a在正常腦組織中主要表達(dá)于神經(jīng)元的胞核，而在膠質(zhì)瘤Ⅱ、Ⅲ級中主要表達(dá)于膠質(zhì)細(xì)胞的胞漿，在膠質(zhì)瘤Ⅳ級中仍未檢測到陽性表達(dá)。我們推測，miR-23a在神經(jīng)元胞核中的表達(dá)一方面可能是由于原位雜交探針不能區(qū)分miRNA前體與成熟體，另一方面不排除miR-23a在膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)生表達(dá)

9、移位，其具體機制有待于進一步研究。
　　 miR-124、miR-149在膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展中可能發(fā)揮抑癌功能
　　 將Lip2000、NC、miR-107、miR-124、miR-138、miR-149 mimics分別轉(zhuǎn)染膠質(zhì)瘤細(xì)胞，通過MTT、細(xì)胞劃痕實驗觀察恢復(fù)這些miRNA的表達(dá)對膠質(zhì)瘤細(xì)胞生物學(xué)行為的影響。MTT實驗表明轉(zhuǎn)染miR-107、miR-124、miR-138、miR-149 mimics后，膠質(zhì)瘤細(xì)胞

10、SF126、U251的生長受到不同程度的抑制，尤其以miR-124、miR-149的抑制作用最為明顯，轉(zhuǎn)染第四天時，與陰性對照組相比，轉(zhuǎn)染miR-124
　　 mimics的細(xì)胞其增長率降低40％，轉(zhuǎn)染miR-149 mimics的細(xì)胞其增長率降低33％；細(xì)胞劃痕實驗表明，miR-124、miR-149能明顯抑制SF126、U251細(xì)胞的遷移能力，劃痕后48 hr，其它各組的傷口均己愈合，而轉(zhuǎn)染miR-124、miR-149 m

11、imics的細(xì)胞其傷口仍清晰可見。以上提示miR-124、miR-149在膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展過程中可能發(fā)揮抑癌功能。
　　 膠質(zhì)瘤不同病理級別差異mRNA動態(tài)表達(dá)譜構(gòu)建
　　 采用全基因組表達(dá)譜芯片檢測用于miRNA芯片分析的3例正常腦組織及13例膠質(zhì)瘤組織中30968個基因的表達(dá)情況，并運用與miRNA芯片數(shù)據(jù)分析同樣的方法進行差異基因篩選。將篩選的各級別膠質(zhì)瘤中差異表達(dá)基因進行整合，探討其在不同病理級別膠質(zhì)瘤中的表達(dá)變化

12、規(guī)律，結(jié)果顯示，差異基因在不同病理級別膠質(zhì)瘤中的表達(dá)模式大致分為14類。BMP1、CDK4、DDX5、DEK、HARS、HNRNPA2B1，IKBKB，LAMA4，p53，PCNA，PLAGL2，TLR3，VCAM1等在各級別膠質(zhì)瘤中均表達(dá)上調(diào)，其中HARS、HNRNPA2B1、p53、PLAGL2的表達(dá)水平與膠質(zhì)瘤的病理分級無明顯關(guān)聯(lián)，BMP1、DDX5、DEK、IKBKB、LAMA4、PCNA、TLR3的表達(dá)水平則與病理分級正相關(guān)；

13、ANXA1、JAK2、JUN、MMP14、RAP1B、STAT1、VCL、VIM等主要在膠質(zhì)瘤Ⅱ、Ⅲ級中表達(dá)上調(diào)；此外，ANK1、APC等在膠質(zhì)瘤Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ級中逐漸表達(dá)下調(diào)。
　　 膠質(zhì)瘤不同病理級別差異mRNA的生物信息學(xué)分析
　　 應(yīng)用基因功能分析軟件DAVID，分別對各級別膠質(zhì)瘤中表達(dá)上調(diào)和表達(dá)下調(diào)的差異基因進行Gene Ontology_BP分析，結(jié)果顯示：膠質(zhì)瘤Ⅰ、Ⅱ級中表達(dá)上調(diào)的基因主要參與轉(zhuǎn)錄調(diào)控、RNA剪

14、接、核酸代謝、生物大分子組裝、細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)等一系列生物學(xué)過程，此外膠質(zhì)瘤Ⅰ級中表達(dá)上調(diào)的基因還參與了細(xì)胞增殖，膠質(zhì)瘤Ⅲ級中表達(dá)上調(diào)的基因則主要參與細(xì)胞凋亡、生物大分子組裝、細(xì)胞粘附、RNA剪接、細(xì)胞周期、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等一系列生物學(xué)過程；膠質(zhì)瘤Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ級中表達(dá)下調(diào)的基因主要參與磷酸化代謝、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、蛋白定位、生物大分子運輸、神經(jīng)元分化等一系列生物學(xué)過程。由此可見，在不同病理級別膠質(zhì)瘤中表達(dá)下調(diào)的基因其生物學(xué)功能大致相似，而表達(dá)上調(diào)的基因其生

15、物學(xué)功能重心發(fā)生了轉(zhuǎn)移，表現(xiàn)為在膠質(zhì)瘤Ⅰ級中以參與轉(zhuǎn)錄調(diào)控、細(xì)胞增殖的基因為主，而在膠質(zhì)瘤Ⅱ、Ⅲ級中參與細(xì)胞凋亡、細(xì)胞粘附的基因逐漸增多。
　　 結(jié)合KEGG數(shù)據(jù)庫，我們發(fā)現(xiàn)在膠質(zhì)瘤中多個信號通路分子，如RAP1B、JUN、FOS、JAK2、STAT1、TCF7L1、IKBKB、TRL3、MYD88等表達(dá)上調(diào)，而信號通路負(fù)調(diào)控因子如DUSP8、APC、CYLD等表達(dá)下調(diào)，提示MAPK，JAK/STAT、WNT、NF-κB、Tol

16、l樣受體等多條信號通路的活化參與了膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展。
　　 膠質(zhì)瘤不同病理級別差異miRNA/mRNA的對接研究
　　 通過對膠質(zhì)瘤不同病理級別差異miRNA/mRNA表達(dá)譜的對接分析，我們發(fā)現(xiàn)，表達(dá)上調(diào)的miRNA中以miR-23a、miR-26a、miR-338-5p、miR-491-3p對接的靶基因數(shù)目較多；表達(dá)下調(diào)的miRNA中以miR-107、miR-124、miR-128a/128b、miR-138、miR-

17、149、miR-181a、miR-181b、miR-302b對接的靶基因數(shù)目較多；差異表達(dá)基因中以PLAGL2、HNRNPA2B1、RAP1B、DEK等對接的miRNA數(shù)目較多，其中RAP1B與miR-149的負(fù)相關(guān)表達(dá)模式已經(jīng)證實，提示一種miRNA可調(diào)控多個基因的表達(dá)，而一個基因的表達(dá)又可受多種miRNA調(diào)控，同時也說明了上述差異miRNA與基因在膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展中可能起重要作用。
　　 綜上所述，我們通過對同一批正常腦組織與