膠質(zhì)瘤microRNA差異表達的研究.pdf

1、研究背景:腦膠質(zhì)瘤(glioma)是中樞神經(jīng)系統(tǒng)最常見的腫瘤,且其發(fā)病率隨年齡增大有增高的趨勢。腦膠質(zhì)瘤通常呈浸潤性生長,具有很強的侵襲能力,手術(shù)難以根治性全切及術(shù)后腫瘤復發(fā),是導致死亡的主要原因之一。因此,研究其發(fā)生發(fā)展的機制,有助于更進一步了解其腫瘤的生物學行為,從而尋找更完善的治療策略。尋找新的潛在的藥物干預靶點,有著重要意義。miRNA是新近發(fā)現(xiàn)的一類小RNA分子,其在生命活動中發(fā)揮了重要調(diào)控作用。異常的miRNAs表達與腫瘤的

2、發(fā)生發(fā)展都密切相關(guān)。如何發(fā)現(xiàn)更多的miRNA及其靶基因的研究在這幾年是繼小干擾RNA之后新的研究熱點之一。
　　 研究目的:研究腦膠質(zhì)瘤組織中miRNA差異表達水平,探討在膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展起重要作用的miRNA和靶基因。進一步明確腦膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展的機制和尋找潛在的腦膠質(zhì)瘤藥物治療靶點。
　　 研究方法:收集腦膠質(zhì)瘤新鮮組織標本6例,非腫瘤腦組織6例,提取總RNA和miRNA,采用丹麥Exiqon公司microRNA8.0分

3、析芯片進行檢測,篩選差異表達的miRNA,采用熒光定量RT-PCR驗證差異表達的miRNA,采用生物信息學軟件分析差異表達的miRNA調(diào)控的靶基因,進而采用RT-PCR和Western-blot方法驗證靶基因mRNA和蛋白的表達水平,探討在膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展起重要作用的miRNA和靶基因。
　　 結(jié)果:本次實驗miRNA芯片采用雙通道系統(tǒng),芯片組內(nèi)重復實驗1次,芯片間技術(shù)重復實驗共3次。應用非等級聚類分析的方法將膠質(zhì)瘤和非腫瘤腦組織

4、放在一起聚類分析,與非腫瘤腦組織相比,共有146個miRNAs在膠質(zhì)瘤組織細胞中有顯著差異,包括11個上調(diào)和39個下調(diào)表達差異較為顯著的miRNAs。在Ⅰ～Ⅱ級膠質(zhì)瘤、非腫瘤腦組織芯片差異性表達的miRNAs中,5個顯著性上調(diào)的miRNAs:miR-122a、miR-296、miR-18b、miR-486、miR-150;17個下調(diào)的miRNAs:miR-106b,miR-503,miR-516-5p,miR-237、miR-15a,m

5、iR-21、miR-17b、miR-361、miR-67b、miR-107、miR-489、miR-330、miR-381、miR-96、miR-409-5p miR-195、miR-200c。在Ⅲ～Ⅳ級膠質(zhì)瘤組織/非腫瘤腦組織芯片差異性表達的miRNAs中,6個顯著性上調(diào)的miRNAs:miR-486、miR-26a、miR-324-3p、miR-46c、miR-18b、miR-30d;22個顯著性下調(diào)的miRNAs:miR-130b

6、、miR-235,miR-21、miR-433,miR-299-5p,miR一99b、miR-520a,miR-542-3p、miR-195,miR-487b,miR-487a,miR-170,miR-96、miR-324-5p,miR-206,miR-4c,miR-193b,miRNAs,miR-237、miR-208、miR-15b。比較Ⅰ～Ⅱ級膠質(zhì)瘤/非腫瘤腦組織和Ⅲ～Ⅳ級膠質(zhì)瘤組織/非腫瘤腦組織兩組芯片,具有相同顯著性差異表達的

7、miRNAs5個(Ratio≥10):其中上調(diào)的有miR-18b、miR-486;下調(diào)的有miR-237、miR-96、miR-21?；诓糠植町惐磉_miRNAs靶基因的分析結(jié)果,預測的靶基因功能涉及細胞周期、細胞運動、腫瘤血管生成等方面。我們選擇預測到的膠質(zhì)瘤細胞中下調(diào)表達的miR-486的靶基因PIRH2和上調(diào)表達的miR21靶基因HDAC7用RT-PCR和western-blot方法進行了驗證,結(jié)果顯示:PIRH2 mRNA和蛋白

8、表達水平均明顯高于非腫瘤腦組織(0.62±0.23 vs0.264±0.29,P=0.020;0.884±0.30 vs0.22±0.26,P=0.004),差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。而HDAC7 mRNA和蛋白表達水平明顯高于非腫瘤腦組織(0.484±0.24 vs0.704±0.18,P=0.010;0.644±0.17 vs0.914±0.23,P=0.003)差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　 結(jié)論:膠

9、質(zhì)瘤細胞中存在差異表達miRNA,這些miRNA包括顯著上調(diào)的miR-18b、miR-486;顯著下調(diào)的有miR-237、miR-96、miR-21、miR-18b、miR-486,提示這些miRNA可能與膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。采用靶基因預測軟件分析膠質(zhì)瘤細胞差異表達的miRNA,發(fā)現(xiàn)它們的調(diào)控的靶基因非常廣泛,涉及癌基因、細胞周期、細胞分化、轉(zhuǎn)錄調(diào)控等,其中下調(diào)表達的miR-486調(diào)控靶基因PIRH2上調(diào)和上調(diào)表達的miR-21調(diào)控靶