γ-干擾素刺激培養(yǎng)imDC過繼治療抗-GBM腎炎的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的:經(jīng)IFN-γ激培養(yǎng)的imDC,過繼轉(zhuǎn)入抗-GBM腎炎模型,觀察經(jīng)IFN-γ刺激后的imDC對抗-GBM腎炎腎臟病變的抑制效果。
　　 方法:以合成多肽序列pCol(28-40)作為抗原,包入脂質(zhì)體內(nèi)制成抗原制劑,建立抗-GBM。腎炎大鼠模型,具體為:第0天(d0)脂質(zhì)體抗原制劑0.25ml,于腳掌和尾根部皮下注射初次致敏;第7天(d7)脂質(zhì)體抗原制劑0.1ml,同部位加強(qiáng)致敏;采集wistar大鼠骨髓,采用經(jīng)典的GM-CS

2、F+IL-4方案制備imDC,經(jīng)imDCIFN-γ刺激培養(yǎng),以合成多肽pCol(28-40)多肽作為外源性抗原處理imDCIFN-γ,流式細(xì)胞儀檢測表面MHCⅡ類分子,及其共刺激分子CD80,CD86和DC表面相對特異性標(biāo)記OX62的表達(dá)情況,在體外與脾臟分離的CD4+T共培養(yǎng),采用MTT比色法檢測CD4+T增殖情況,Annexin-v法檢測CD4+T凋亡情況,酶聯(lián)免疫吸附法檢測脾細(xì)胞培養(yǎng)液中IL-4、IL-13、IFN-γ的含量,觀察

3、體外抗原特異性T細(xì)胞功能活性狀態(tài);并于首次致敏前7天(-d7)過繼轉(zhuǎn)入抗-GBM腎炎模型,間隔7天隨機(jī)選取相關(guān)樣本進(jìn)行生化指標(biāo)(24小時(shí)尿白蛋白,血清肌酐,血尿素氮)腎臟病理學(xué)、免疫學(xué)指標(biāo),病理學(xué)、免疫學(xué)檢查,觀察對抗-GBM腎炎腎小球病變抑制效果及抗原特異性免疫耐受的相關(guān)機(jī)制.
　　 結(jié)果:(1)光鏡下觀察imDC IFN-γ細(xì)胞呈圓形或卵圓形,細(xì)胞膜略不規(guī)則,有少量的短小突起或偽足。流式細(xì)胞儀檢測imDC和imDCIFN-γ

4、表面低表達(dá)的MHCⅡ類分子(14.01％)及共刺激分子CD80(4.78％)、CD86(19.79％),同樣低表達(dá)DC表面相對特異性標(biāo)記OX62(15.31％)(p＜0.05,n=4)的水平都顯著低于mDC;
　　 (2)抗-GBM腎炎大鼠模型組大鼠尿蛋白,血肌酐,血尿素氮短期內(nèi)明顯升高(P＜0.05,n=10)、HE染色腎小球系膜細(xì)胞數(shù)增多,炎細(xì)胞浸潤,PAS染色均有細(xì)胞性新月體形成(占腎小囊>50％)、免疫熒光可見大量IgG

5、線樣沉積;電鏡可見足突融合,基底膜增厚,內(nèi)皮細(xì)胞增生,免疫復(fù)合物沉積。
　　 (3)體外共培養(yǎng)的脾淋巴細(xì)胞,imDC組與對照組增殖無顯著性差異;而imDCIFN-γ組與對照組增殖明顯受抑制,對照組OD值(0.1950±0.0160.);imDC組OD值(0.1974±0.017);imDCIFN-γ組為OD值(0.836±0.012)(p＜0.05,n=5);imDCIFN-γ組凋亡率為(12.98+0.02),與對照組和imD

6、C組相比凋亡均明顯增高(p＜0.05,n=5);上調(diào)了Th2型細(xì)胞因子IL-4及IL-13的表達(dá),而下調(diào)Th1型細(xì)胞因子IFN-γ;Th1型細(xì)胞因子明顯向Th2型細(xì)胞因子偏移。進(jìn)一步體內(nèi)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),過繼轉(zhuǎn)入imDCIFN-γ后均能明顯降低尿蛋白,血肌酐,血尿素氮水平,同時(shí)期亦減少炎細(xì)胞浸潤,細(xì)胞新月體形成比率和速度減少,免疫熒光檢測發(fā)現(xiàn)IgG沉積減少,熒光強(qiáng)度減弱;過繼轉(zhuǎn)入imDCIFN-γ能夠抑制細(xì)胞性新月體形成,能明顯緩解抗-GBM腎

7、炎病情的進(jìn)展,對抗-GBM腎炎具有保護(hù)作用
　　 結(jié)論:
　　 1.imDCIFN-γ對外源性抗原多肽pCol(28-40)攝取及提呈能力明顯下降;可抑制T細(xì)胞增殖,促進(jìn)T細(xì)胞凋亡;實(shí)驗(yàn)還表明:IFN-γ刺激培養(yǎng)的未成熟樹突狀細(xì)胞促使Th1型細(xì)胞因子向Th2型細(xì)胞因子偏移,誘導(dǎo)形成特異性抗原免疫耐受。
　　 2.成功建立了抗-GBM腎炎大鼠模型
　　 3.IFN-γ刺激培養(yǎng)的imDC過繼轉(zhuǎn)入模型大鼠,可誘