干擾素刺激基因16(ISG16)的克隆表達(dá)及其對(duì)丙型肝炎病毒和Ⅰ型干擾素信號(hào)通路的影響研究.pdf

1、背景:丙型肝炎病毒(Hepatitis C Virus，HCV)引起的慢性丙型肝炎是一種嚴(yán)重的傳染性肝臟疾病，目前全球感染者約1.5億。感染HCV后，只有20％的感染者可以自發(fā)清除病毒，而且HCV感染造成的慢性化程度較高，是引起肝硬化、肝纖維化以及肝癌的主要原因之一。丙型肝炎的標(biāo)準(zhǔn)治療方法是聚乙二醇干擾素(pegylated-interferon，PEG-IFN)聯(lián)合利巴韋林(Ribavirin，RBV)，但是存在療程長(zhǎng)、費(fèi)用高、副作用

2、大等缺陷。本課題組在前期研究中使用基因芯片技術(shù)從采用干擾素治療的丙肝患者有效和無(wú)效病人肝組織中篩選出18個(gè)差異表達(dá)基因，其中，在治療無(wú)效患者的治療前的肝穿組織中，干擾素刺激基因16(interferon-stimulated gene16，ISG16)呈現(xiàn)高表達(dá)。ISG16是最早發(fā)現(xiàn)的能夠被Ⅰ型干擾素誘導(dǎo)的干擾素刺激基因之一，但是ISG16對(duì)HCV復(fù)制以及Ⅰ型干擾素信號(hào)通路的影響還沒(méi)有相關(guān)研究。
　　目的:在HCVcc體外培養(yǎng)細(xì)胞

3、模型（Huh7.5.1細(xì)胞）和HCV復(fù)制子細(xì)胞(Con1b細(xì)胞)中高表達(dá)ISG16，研究ISG16高表達(dá)對(duì)HCV復(fù)制以及Ⅰ型干擾素抗病毒作用的影響;研究ISG16對(duì)Ⅰ型干擾素信號(hào)通路的影響;研究ISG16在經(jīng)干擾素治療后有效和無(wú)效的丙型肝炎患者外周血單核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMCs)中的表達(dá)差異。最終闡明ISG16在HCV復(fù)制，干擾素抗HCV活性，Ⅰ型干擾素信號(hào)通路及HCV逃逸宿

4、主先天免疫中的作用。
　　方法:采用基因克隆方法構(gòu)建ISG16高表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1-3×tag-ISG16，轉(zhuǎn)染Huh7.5.1和Con1b細(xì)胞，采用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Realtime-PCR)檢測(cè)ISG16、HCV以及其他ISGs的表達(dá);采用蛋白質(zhì)印跡法(Western Blot，WB)檢測(cè)ISG16蛋白表達(dá)和P-STAT1磷酸化水平;采用雙熒光報(bào)告基因法檢測(cè)干擾素刺激反應(yīng)元件(interferon-stimul

5、ated response element，ISRE)的活性。以此探討ISG16對(duì)HCV復(fù)制、干擾素抗病毒作用以及Ⅰ型干擾素信號(hào)通路的影響。抽取經(jīng)干擾素治療后的丙型肝炎患者的靜脈血，分離得到PBMCs，體外培養(yǎng)經(jīng)Ⅰ型干擾素(IFN-α)刺激后，檢測(cè)PBMCs中ISG16的表達(dá)水平。
　　結(jié)果:構(gòu)建的ISG16高表達(dá)質(zhì)粒，成功在Huh7.5.1和Con1b細(xì)胞中表達(dá);ISG16高表達(dá)能夠促進(jìn)HCV復(fù)制，抑制IFN-α抗病毒作用，對(duì)Ⅰ

6、型干擾素信號(hào)通路中的關(guān)鍵點(diǎn)具有明顯影響:延長(zhǎng)P-STAT1的磷酸化時(shí)間，抑制ISRE活性;在丙型肝炎患者PBMCs中，治療有效和無(wú)效之間的本底表達(dá)比較發(fā)現(xiàn)，治療無(wú)效者本底表達(dá)較高，但是由于樣本量較少，結(jié)果無(wú)顯著性差異，治療有效者經(jīng)IFN-α刺激后，ISG16表達(dá)升高更顯著。
　　結(jié)論:ISG16能夠促進(jìn)HCV復(fù)制，抑制IFN-α的抗病毒作用，這種作用可能是通過(guò)影響Ⅰ型干擾素信號(hào)通路中的關(guān)鍵點(diǎn)來(lái)實(shí)現(xiàn)的;丙肝病毒感染后導(dǎo)致ISG16表