豌豆膽色素原脫氨酶新型表達(dá)載體構(gòu)建與定點(diǎn)突變.pdf

1、　　所有卟啉類化合物生物合成共有途徑由三個(gè)酶催化，它們分別是5-氨基酮戊酸脫水酶(ALAD)，膽色素原脫氨酶(ilinogendeaminase，PBGD)和尿卟啉原Ⅲ合酶。PBGD是共有途徑的調(diào)控酶。為研究豌豆膽色素脫氨酶在大腸桿菌的高效表達(dá)，本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建了PBGD的T5啟動(dòng)子下的雙標(biāo)簽表達(dá)載體pQE30PBGD和T7啟動(dòng)子下的雙標(biāo)簽表達(dá)載體p28PBGD，雙標(biāo)簽分別為組氨酸標(biāo)簽和抗鏈霉素蛋白短肽標(biāo)簽。為確定酶的保守氨基酸殘基Ala18

2、8對(duì)酶活的貢獻(xiàn)，本實(shí)驗(yàn)將Ala188突變成Ser188，測(cè)序驗(yàn)證。為防止PBGD催化的產(chǎn)物尿卟啉原Ⅰ毒害轉(zhuǎn)化細(xì)胞，將枯草桿菌UROS的表達(dá)載體和p28PBGD共轉(zhuǎn)化。為調(diào)控PBGD的表達(dá)，我們又將合成膽色素原(PBGD輔基成分)的5-氨基酮戊酸脫水酶的表達(dá)載體和p28PBGD共轉(zhuǎn)化。分別誘導(dǎo)表達(dá)p28PBG/pA-ALAD和p28PBGD/pA-UROS，Ni-NTA親和層析柱純化。結(jié)果如下：1.構(gòu)建了T5啟動(dòng)子下的pQE30sPBGD

3、和T7啟動(dòng)子下的p28PBGD表達(dá)載體，表達(dá)重組豌豆膽色素脫氨酶，它的C-端含有8個(gè)氨基酸短肽的strep標(biāo)簽，N-端含有組氨酸標(biāo)簽。2.定點(diǎn)突變膽色素原脫氨酶保守氨基酸A188S。3.分別將膽色素原脫氨酶的上游和下游的兩個(gè)酶5-氨基酮戊酸脫水酶和尿卟啉原Ⅲ合酶，插入pET-3a，再將酶切的含T7啟動(dòng)子和RBS序列的兩個(gè)酶的基因序列插入pCYC184中。4.S分別誘導(dǎo)表達(dá)p28PBG/pA-ALADBL21(DE3)和p28PBGD/p