人HMGB1基因原核表達(dá)載體的構(gòu)建與表達(dá).pdf

1、山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院碩士學(xué)位論文人HMGB1基因原核表達(dá)載體的構(gòu)建與表達(dá)姓名：崔彬申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：碩士專業(yè)：免疫學(xué)指導(dǎo)教師：趙躍然20100301山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院碩+ 學(xué)位論文基于上述研究，本課題擬采用基因工程技術(shù)，將H M G B l 基因行密碼子優(yōu)化后合成，構(gòu)建人H M G B l 基因原核表達(dá)載體，并初步研究其在大腸桿菌中的表達(dá)和純化，獲得重組蛋白并進(jìn)行鑒定，為進(jìn)一步研究其生物學(xué)功能及探討其調(diào)控機(jī)制奠定基礎(chǔ)。方法和結(jié)果1 ．人H M G

2、 B l 基因克隆及序列分析用O p t i m u m G e n e T M 軟件對(duì)人H M G B l 原始序列行密碼子優(yōu)化并合成目的基因，插入克隆載體p U C 5 7 中構(gòu)建質(zhì)粒p U C 5 7 ．H M G B l 。并根據(jù)人H M G B l 編碼序列設(shè)計(jì)特異性擴(kuò)增引物，上游引物5 ’端加入起始密碼子A T G 和限制性酶切位點(diǎn)N d e I ，下游引物5 ’端加入限制性酶切位點(diǎn)X h oI ，以利于重組表達(dá)載體的構(gòu)建。

3、以質(zhì)粒p U C 5 7 ．H M G B l 為模板，用T a q D N A 聚合酶進(jìn)行P C R 擴(kuò)增H M G B l目的基因片段。P C R 產(chǎn)物經(jīng)1 ％瓊脂糖凝膠電泳分析，使用凝膠回收試劑盒純化。將純化的目的片段與p M D l 9 ．TS i m p l e V e c t o r 連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，接種于終濃度1 0 0 u g ／m l 氨芐青霉素的L B 平板。經(jīng)菌落P C R 和限制性酶譜分析初步鑒定后，采用A

4、B I3 1 0 0 一A v a n t 全自動(dòng)D N A 測(cè)序儀進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序結(jié)果顯示：克隆的基因與優(yōu)化后的H M G B l 基因序列完全一致，并成功構(gòu)建人H M G B l 重組質(zhì)粒p M D l 9 一T ／H M G B l 。2 ．人H M G B l 基因在大腸桿菌中的表達(dá)及重組蛋白的鑒定和純化用限制性內(nèi)切酶N d eI 和X h o I 雙酶切重組質(zhì)粒p M D l 9 一T ／H M G B l ，瓊脂糖凝膠電泳分離

5、純化H M G B l 片斷，插入原核表達(dá)載體p Q E ．T 7 ．2 ，構(gòu)建重組H M G B l 表達(dá)載體p Q E ．T 7 ．2 ／H M G B l 。經(jīng)菌落P C R 和限制性酶譜分析篩選重組的陽(yáng)性克隆，轉(zhuǎn)化大腸桿菌B L 2 1 ( D E 3 ) ，異丙基．D ．D 一硫代半乳糖苷( I P T G ) 誘導(dǎo)重組蛋白表達(dá)，3 7 “ C 條件下誘導(dǎo)4 小時(shí)，分別留取誘導(dǎo)前對(duì)照及誘導(dǎo)后菌液，采用S D S ．P A G

6、E 凝膠電泳和W e s t e r nb l o t 印跡法鑒定重組蛋白，N i - N T A 樹脂親和純化目的蛋白。結(jié)果顯示：成功構(gòu)建重組H M G B l 表達(dá)載體p Q E - T 7 ．2 ／H M G B l ，表達(dá)蛋白約占菌體總蛋白的2 0 ％左右，W e s t e r n b l o t 顯示重組蛋白能與抗H M G B l 抗體和抗H i s 抗體特異結(jié)合，為特異性H M G B l 蛋白，H M G B l 融合