Hlx對Th1-Th2平衡的調(diào)節(jié)及其與腦-脊髓損傷關系的研究.pdf

1、目的:
　　Hlx在胚胎發(fā)育、胃腸功能及脊髓神經(jīng)生長等方面發(fā)揮著重要的作用，同時也是參與CD4陽性T細胞分化調(diào)節(jié)的重要轉錄因子。鑒于Hlx對相關組織細胞生長發(fā)育和免疫細胞調(diào)節(jié)的雙重作用，本研究在考察Hlx對樹突狀細胞免疫功能調(diào)節(jié)作用的基礎上，分析其在腦脊髓損傷介導的炎癥應答中的作用和免疫應答類型，了解其對消化系腫瘤患者免疫狀態(tài)的影響。
　　(1)為了體外探討轉錄因子Hlx在樹突狀細胞中的作用，構建攜有小鼠Hlx基因的真核表達

2、質粒，轉染鼠樹突狀細胞系，建立穩(wěn)定高表達Hlx的小鼠DC2.4細胞株，研究其生物學行為和功能的改變，并作為一種工具，為進一步研究Hlx對樹突狀細胞免疫功能的影響和在免疫應答調(diào)節(jié)中的作用奠定基礎。
　　(2)建立腦脊髓損傷動物模型，并在建立大鼠腦脊髓損傷動物模型的基礎上，通過分析腦脊髓損傷大鼠的Th1和Th2兩類細胞因子的基因表達與轉錄因子T-bet和GATA3表達的相關性，從細胞因子與轉錄因子的角度考證腦脊髓損傷的大鼠Th1/Th

3、2細胞分化趨勢和大鼠腦脊髓炎癥與T-bet和IFN-γ的相關性，了解T-bet、IFN-γ與腦脊髓損傷與炎癥發(fā)生發(fā)展之間的關系。介于Hlx對胚胎發(fā)育和免疫應答調(diào)節(jié)的雙重作用，對Hlx在腦脊髓損傷時Th1/Th2細胞平衡狀態(tài)的影響進行分析。
　　(3)應用熒光定量PCR方法檢測消化系腫瘤（胃癌）患者外周血單個核細胞中Hlx mRNA表達水平的改變，分析Hlx對患者機體Th1/Th2平衡狀態(tài)的影響，探討Hlx在疾病發(fā)生發(fā)展中的作用。<

4、br>　　方法:
　　(1)構建pIRES2-mHlx-EGFP:采用PCR方法，以含Hlx基因的PGEM-T質粒為模板擴增Hlx基因，將其克隆至pIRES2-EGFP真核載體，進而通過PCR，雙酶切篩選陽性克隆并進行序列測定。
　　(2)篩選獲得高表達Hlx的DC2.4細胞系:用脂質體將pIRES2-mHlx-EGFP轉入DC2.4細胞，經(jīng)600μg/ml G418篩選和根據(jù)EGFP標記進行克隆、亞克隆，獲得穩(wěn)定表達EGF

5、P的抗性DC2.4細胞株，再經(jīng)RT-PCR、Western-blot篩選出穩(wěn)定高表達Hlx的細胞克隆。
　　(3)應用real-time PCR檢測DC2.4/Hlx細胞或胃癌患者外周血單個核細胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMC) Hlx、T-bet、GATA3、IFN-γ、IL-4、IL-12p40、IL-12p35、IL-6等因子的表達變化;胃癌患者測得的Hlx與健康對照組進行比

6、較研究，與此同時分析胃癌患者Hlx表達的水平與T-bet表達的關系，著眼轉錄因子水平探討患者機體Th1/Th2細胞平衡失調(diào)的可能機制。
　　(4)ELISA方法檢測細胞培養(yǎng)上清和外周血中IFN-γ、IL-12P70、TNF-α、IL-10等相關細胞因子的表達水平。
　　(5)流式細胞儀分析細胞表面分子的改變:應用PE標記的MHCI、MHCII、CD40、CD80、CD86、TLR4、CCR7單克隆抗體對不同細胞株進行染色，再

7、應用流式細胞儀分析表面分子的變化。
　　(6)樹突狀細胞吞噬功能分析:高表達Hlx的DC2.4細胞系與表達紅色熒光蛋白HcRed的大腸埃希菌（經(jīng)3％多聚甲醛固定）共育于37℃2h，F(xiàn)ACS分析吞噬大腸埃希菌的樹突狀細胞數(shù)，以此反映高表達Hlx的DC2.4細胞吞噬功能狀態(tài)（設定LPS刺激組為陽性對照）。
　　(7)樹突狀細胞抗原提呈作用:100 mg/L OVA刺激樹突狀細胞（包括高表達Hlx的DC2.4）24h，然后于37℃

8、下用30 mg/L的mitomycin C處理20分鐘，冷PBS洗兩次備用。無菌分離OVA免疫的C57BL/6小鼠脾臟，MACS分離CD4+的T細胞，3 mmol/L CFSE染色后備用。于24孔板中接種2×106個CFSE標記的CD4+T細胞和2×105個樹突狀細胞，共培養(yǎng)3天，流式細胞儀分析。
　　(8) MTT法檢測細胞增殖:于96孔板每孔接種2×105CD4+T細胞和2×104個樹突狀細胞共培養(yǎng)，三天后MTT法檢測細胞增殖

9、狀態(tài)。
　　(9)腦、脊髓損傷大鼠模型的制備:采用物理損傷和LPS損傷模型，即用0.3％戊巴比妥鈉(10ml/kg)腹腔麻醉后，經(jīng)T12椎體棘突行背正中切口，鈍性分離皮膚和肌肉，把胸十一到腰一的棘突及椎板暴露出來，然后用止血鉗去掉胸十二的棘突及椎板，使脊髓兩側和背側充分暴露，切斷脊髓，大鼠雙下肢對稱性抽搐，隨后出現(xiàn)癱瘓，縫合肌層及皮膚復制脊髓橫斷損傷模型。LPS損傷模型則是在充分暴露脊髓背側和兩側后于蛛網(wǎng)膜下腔注射LPS。

10、　　結果
　　(1)建立了穩(wěn)定高表達mHlx的DC2.4細胞株(DC2.4/mHlx):PIRES2-mHlx-EGFP和PIRES2-EGFP分別轉染樹突狀細胞系DC2.4，經(jīng)G418抗性篩選得到抗性細胞株，再經(jīng)FACS、RT-PCR、Western-blot鑒定，并經(jīng)克隆化獲得高表達mHlx的DC2.4/mHlx細胞株。
　　(2)高表達Hlx的DC2.4顯示促Th1細胞分化的潛能和抗原提呈功能的改善:RT-PCR結果表

11、明，過表達Hlx的DC2.4/Hlx，其T-bet、Hlx、IFN-γ、IL-12p35、IL-12p40、IL-6的mRNA水平均增加，而轉錄因子GATA3無明顯改變，IL-4表達陰性;ELISA結果表明，細胞培養(yǎng)上清中細胞因子IFN-γ和Il-12p70分泌增加。反映抗原提呈功能的表面分子分析結果顯示，MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ、CD80、CD86、CD40等表達均增加，吞噬能力明顯下降，體外特異性抗原提呈能力明顯增強。
　　(3

12、)在LPS刺激腦脊髓損傷的模型中，大鼠的腦組織和脊髓組織中T-bet與IFN-γ的表達水平明顯高于正常對照組，GATA3、IL-4的表達卻沒有明顯改變。此外，ELISA檢測損傷的腦脊髓組織勻漿中TNF-α和IL-10細胞因子水平表明，TNF-α在損傷的開始即明顯升高;而IL-10則在損傷早期呈低表達，而中后期則呈升高趨勢。這表明在腦脊髓損傷早期可能表現(xiàn)為Th1細胞分化優(yōu)勢，這與IFN-γ表達上調(diào)的結果相一致。
　　(4)對腦、脊髓

13、損傷模型Hlx的分析結果顯示，在LPS刺激腦、脊髓損傷的模型中，大鼠的腦組織和脊髓組織中，Hlx的表達水平顯著升高并同時伴有T-bet和IFN-γ的高表達，而GATA3、IL-4的表達卻沒有明顯改變。通過相關性分析表明，脊髓損傷后脊髓中Hlx的表達水平與T-bet、IFN-γ的表達存在高度相關性;且基于Hlx和T-bet調(diào)控的IFN-γ表達水平與大鼠腦、脊髓損傷的程度也存在著密切的關系，表明IFN-γ作為Th1細胞特異性細胞因子，在脊髓

14、損傷過程中發(fā)揮重要作用;同時也提示在脊髓損傷時可能有T細胞的浸入，并在Hlx和T-bet的共同作用下維持著Th1細胞優(yōu)勢狀態(tài)和高IFN-γ表達水平，對脊髓二次免疫炎癥性損傷起著促進的作用。
　　然而在脊髓橫斷損傷的腦組織中，盡管IFN-γ的表達升高，但轉錄因子Hlx、T-bet和GATA3的表達都沒有明顯改變，推測Th1細胞及其它來源的IFN-γ等細胞因子可釋入受損腦組織，而存在于Th1或Th2細胞內(nèi)的核轉錄因子T-bet、Hlx

15、或GATA3，則可因T細胞未能及時浸入腦組織或浸潤腦組織較少而呈低水平表達。
　　(5)實時熒光定量PCR測定胃癌病人PBMC中Hlx的表達水平:結果可見，Hlx的mRNA表達水平明顯低于健康對照組，且與T-bet表達水平呈明顯正相關。提示胃癌患者存在著Hlx和T-bet表達同步下降的趨勢，可能是腫瘤患者機體殺瘤特異性Th1細胞功能或比率降低的重要因素。推測，基于Hlx表達低下的Th2細胞優(yōu)勢分化趨勢，及其所導致的Th1/Th2細

16、胞平衡失調(diào)，也許構成消化系腫瘤患者機體免疫微環(huán)境的基本狀態(tài)。
　　結論:
　　在未成熟樹突狀細胞系DC2.4中，過表達轉錄因子Hlx，可以促進IFN-γ的轉錄和表達，進而促使樹突狀細胞成熟、IL-12分泌增加、吞噬能力下降、抗原提呈能力增強。能夠更有效的促進同基因型來源的CD4+T細胞的分裂增殖。
　　Hlx表達水平與腦脊髓損傷介導的免疫炎癥有關，其可促進損傷機體Th1細胞優(yōu)勢分化狀態(tài)，對脊髓二次免疫炎癥性損傷起著推波

17、助瀾的作用。在損傷的脊髓和腦組織中存在著細胞因子IFN-γ和Th1細胞特征性轉錄因子T-bet、Hlx的分布差異，可能因為脊髓損傷時發(fā)生了T細胞的浸入，使其特征性轉錄因子在脊髓的表達增加;而T細胞因未能及時浸入腦組織或浸潤腦組織較少，使轉錄因子T-bet、Hlx在腦組織中的表達水平?jīng)]有明顯改變，但Th1細胞特征性細胞因子IFN-γ仍在損傷腦組織表現(xiàn)為上調(diào)。
　　由于Hlx對胃腸組織發(fā)育起重要作用，因此我們檢測了Hlx在胃癌患者中表