Hlx對(duì)Th1-Th2平衡的調(diào)節(jié)及其與腦-脊髓損傷關(guān)系的研究.pdf

1、目的:
　　Hlx在胚胎發(fā)育、胃腸功能及脊髓神經(jīng)生長等方面發(fā)揮著重要的作用，同時(shí)也是參與CD4陽性T細(xì)胞分化調(diào)節(jié)的重要轉(zhuǎn)錄因子。鑒于Hlx對(duì)相關(guān)組織細(xì)胞生長發(fā)育和免疫細(xì)胞調(diào)節(jié)的雙重作用，本研究在考察Hlx對(duì)樹突狀細(xì)胞免疫功能調(diào)節(jié)作用的基礎(chǔ)上，分析其在腦脊髓損傷介導(dǎo)的炎癥應(yīng)答中的作用和免疫應(yīng)答類型，了解其對(duì)消化系腫瘤患者免疫狀態(tài)的影響。
　　(1)為了體外探討轉(zhuǎn)錄因子Hlx在樹突狀細(xì)胞中的作用，構(gòu)建攜有小鼠Hlx基因的真核表達(dá)

2、質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染鼠樹突狀細(xì)胞系，建立穩(wěn)定高表達(dá)Hlx的小鼠DC2.4細(xì)胞株，研究其生物學(xué)行為和功能的改變，并作為一種工具，為進(jìn)一步研究Hlx對(duì)樹突狀細(xì)胞免疫功能的影響和在免疫應(yīng)答調(diào)節(jié)中的作用奠定基礎(chǔ)。
　　(2)建立腦脊髓損傷動(dòng)物模型，并在建立大鼠腦脊髓損傷動(dòng)物模型的基礎(chǔ)上，通過分析腦脊髓損傷大鼠的Th1和Th2兩類細(xì)胞因子的基因表達(dá)與轉(zhuǎn)錄因子T-bet和GATA3表達(dá)的相關(guān)性，從細(xì)胞因子與轉(zhuǎn)錄因子的角度考證腦脊髓損傷的大鼠Th1/Th

3、2細(xì)胞分化趨勢(shì)和大鼠腦脊髓炎癥與T-bet和IFN-γ的相關(guān)性，了解T-bet、IFN-γ與腦脊髓損傷與炎癥發(fā)生發(fā)展之間的關(guān)系。介于Hlx對(duì)胚胎發(fā)育和免疫應(yīng)答調(diào)節(jié)的雙重作用，對(duì)Hlx在腦脊髓損傷時(shí)Th1/Th2細(xì)胞平衡狀態(tài)的影響進(jìn)行分析。
　　(3)應(yīng)用熒光定量PCR方法檢測(cè)消化系腫瘤（胃癌）患者外周血單個(gè)核細(xì)胞中Hlx mRNA表達(dá)水平的改變，分析Hlx對(duì)患者機(jī)體Th1/Th2平衡狀態(tài)的影響，探討Hlx在疾病發(fā)生發(fā)展中的作用。<

4、br>　　方法:
　　(1)構(gòu)建pIRES2-mHlx-EGFP:采用PCR方法，以含Hlx基因的PGEM-T質(zhì)粒為模板擴(kuò)增Hlx基因，將其克隆至pIRES2-EGFP真核載體，進(jìn)而通過PCR，雙酶切篩選陽性克隆并進(jìn)行序列測(cè)定。
　　(2)篩選獲得高表達(dá)Hlx的DC2.4細(xì)胞系:用脂質(zhì)體將pIRES2-mHlx-EGFP轉(zhuǎn)入DC2.4細(xì)胞，經(jīng)600μg/ml G418篩選和根據(jù)EGFP標(biāo)記進(jìn)行克隆、亞克隆，獲得穩(wěn)定表達(dá)EGF

5、P的抗性DC2.4細(xì)胞株，再經(jīng)RT-PCR、Western-blot篩選出穩(wěn)定高表達(dá)Hlx的細(xì)胞克隆。
　　(3)應(yīng)用real-time PCR檢測(cè)DC2.4/Hlx細(xì)胞或胃癌患者外周血單個(gè)核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMC) Hlx、T-bet、GATA3、IFN-γ、IL-4、IL-12p40、IL-12p35、IL-6等因子的表達(dá)變化;胃癌患者測(cè)得的Hlx與健康對(duì)照組進(jìn)行比

6、較研究，與此同時(shí)分析胃癌患者Hlx表達(dá)的水平與T-bet表達(dá)的關(guān)系，著眼轉(zhuǎn)錄因子水平探討患者機(jī)體Th1/Th2細(xì)胞平衡失調(diào)的可能機(jī)制。
　　(4)ELISA方法檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清和外周血中IFN-γ、IL-12P70、TNF-α、IL-10等相關(guān)細(xì)胞因子的表達(dá)水平。
　　(5)流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞表面分子的改變:應(yīng)用PE標(biāo)記的MHCI、MHCII、CD40、CD80、CD86、TLR4、CCR7單克隆抗體對(duì)不同細(xì)胞株進(jìn)行染色，再

7、應(yīng)用流式細(xì)胞儀分析表面分子的變化。
　　(6)樹突狀細(xì)胞吞噬功能分析:高表達(dá)Hlx的DC2.4細(xì)胞系與表達(dá)紅色熒光蛋白HcRed的大腸埃希菌（經(jīng)3％多聚甲醛固定）共育于37℃2h，F(xiàn)ACS分析吞噬大腸埃希菌的樹突狀細(xì)胞數(shù)，以此反映高表達(dá)Hlx的DC2.4細(xì)胞吞噬功能狀態(tài)（設(shè)定LPS刺激組為陽性對(duì)照）。
　　(7)樹突狀細(xì)胞抗原提呈作用:100 mg/L OVA刺激樹突狀細(xì)胞（包括高表達(dá)Hlx的DC2.4）24h，然后于37℃

8、下用30 mg/L的mitomycin C處理20分鐘，冷PBS洗兩次備用。無菌分離OVA免疫的C57BL/6小鼠脾臟，MACS分離CD4+的T細(xì)胞，3 mmol/L CFSE染色后備用。于24孔板中接種2×106個(gè)CFSE標(biāo)記的CD4+T細(xì)胞和2×105個(gè)樹突狀細(xì)胞，共培養(yǎng)3天，流式細(xì)胞儀分析。
　　(8) MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖:于96孔板每孔接種2×105CD4+T細(xì)胞和2×104個(gè)樹突狀細(xì)胞共培養(yǎng)，三天后MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖

9、狀態(tài)。
　　(9)腦、脊髓損傷大鼠模型的制備:采用物理損傷和LPS損傷模型，即用0.3％戊巴比妥鈉(10ml/kg)腹腔麻醉后，經(jīng)T12椎體棘突行背正中切口，鈍性分離皮膚和肌肉，把胸十一到腰一的棘突及椎板暴露出來，然后用止血鉗去掉胸十二的棘突及椎板，使脊髓兩側(cè)和背側(cè)充分暴露，切斷脊髓，大鼠雙下肢對(duì)稱性抽搐，隨后出現(xiàn)癱瘓，縫合肌層及皮膚復(fù)制脊髓橫斷損傷模型。LPS損傷模型則是在充分暴露脊髓背側(cè)和兩側(cè)后于蛛網(wǎng)膜下腔注射LPS。

10、　　結(jié)果
　　(1)建立了穩(wěn)定高表達(dá)mHlx的DC2.4細(xì)胞株(DC2.4/mHlx):PIRES2-mHlx-EGFP和PIRES2-EGFP分別轉(zhuǎn)染樹突狀細(xì)胞系DC2.4，經(jīng)G418抗性篩選得到抗性細(xì)胞株，再經(jīng)FACS、RT-PCR、Western-blot鑒定，并經(jīng)克隆化獲得高表達(dá)mHlx的DC2.4/mHlx細(xì)胞株。
　　(2)高表達(dá)Hlx的DC2.4顯示促Th1細(xì)胞分化的潛能和抗原提呈功能的改善:RT-PCR結(jié)果表

11、明，過表達(dá)Hlx的DC2.4/Hlx，其T-bet、Hlx、IFN-γ、IL-12p35、IL-12p40、IL-6的mRNA水平均增加，而轉(zhuǎn)錄因子GATA3無明顯改變，IL-4表達(dá)陰性;ELISA結(jié)果表明，細(xì)胞培養(yǎng)上清中細(xì)胞因子IFN-γ和Il-12p70分泌增加。反映抗原提呈功能的表面分子分析結(jié)果顯示，MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ、CD80、CD86、CD40等表達(dá)均增加，吞噬能力明顯下降，體外特異性抗原提呈能力明顯增強(qiáng)。
　　(3

12、)在LPS刺激腦脊髓損傷的模型中，大鼠的腦組織和脊髓組織中T-bet與IFN-γ的表達(dá)水平明顯高于正常對(duì)照組，GATA3、IL-4的表達(dá)卻沒有明顯改變。此外，ELISA檢測(cè)損傷的腦脊髓組織勻漿中TNF-α和IL-10細(xì)胞因子水平表明，TNF-α在損傷的開始即明顯升高;而IL-10則在損傷早期呈低表達(dá)，而中后期則呈升高趨勢(shì)。這表明在腦脊髓損傷早期可能表現(xiàn)為Th1細(xì)胞分化優(yōu)勢(shì)，這與IFN-γ表達(dá)上調(diào)的結(jié)果相一致。
　　(4)對(duì)腦、脊髓

13、損傷模型Hlx的分析結(jié)果顯示，在LPS刺激腦、脊髓損傷的模型中，大鼠的腦組織和脊髓組織中，Hlx的表達(dá)水平顯著升高并同時(shí)伴有T-bet和IFN-γ的高表達(dá)，而GATA3、IL-4的表達(dá)卻沒有明顯改變。通過相關(guān)性分析表明，脊髓損傷后脊髓中Hlx的表達(dá)水平與T-bet、IFN-γ的表達(dá)存在高度相關(guān)性;且基于Hlx和T-bet調(diào)控的IFN-γ表達(dá)水平與大鼠腦、脊髓損傷的程度也存在著密切的關(guān)系，表明IFN-γ作為Th1細(xì)胞特異性細(xì)胞因子，在脊髓

14、損傷過程中發(fā)揮重要作用;同時(shí)也提示在脊髓損傷時(shí)可能有T細(xì)胞的浸入，并在Hlx和T-bet的共同作用下維持著Th1細(xì)胞優(yōu)勢(shì)狀態(tài)和高IFN-γ表達(dá)水平，對(duì)脊髓二次免疫炎癥性損傷起著促進(jìn)的作用。
　　然而在脊髓橫斷損傷的腦組織中，盡管IFN-γ的表達(dá)升高，但轉(zhuǎn)錄因子Hlx、T-bet和GATA3的表達(dá)都沒有明顯改變，推測(cè)Th1細(xì)胞及其它來源的IFN-γ等細(xì)胞因子可釋入受損腦組織，而存在于Th1或Th2細(xì)胞內(nèi)的核轉(zhuǎn)錄因子T-bet、Hlx

15、或GATA3，則可因T細(xì)胞未能及時(shí)浸入腦組織或浸潤腦組織較少而呈低水平表達(dá)。
　　(5)實(shí)時(shí)熒光定量PCR測(cè)定胃癌病人PBMC中Hlx的表達(dá)水平:結(jié)果可見，Hlx的mRNA表達(dá)水平明顯低于健康對(duì)照組，且與T-bet表達(dá)水平呈明顯正相關(guān)。提示胃癌患者存在著Hlx和T-bet表達(dá)同步下降的趨勢(shì)，可能是腫瘤患者機(jī)體殺瘤特異性Th1細(xì)胞功能或比率降低的重要因素。推測(cè)，基于Hlx表達(dá)低下的Th2細(xì)胞優(yōu)勢(shì)分化趨勢(shì)，及其所導(dǎo)致的Th1/Th2細(xì)

16、胞平衡失調(diào)，也許構(gòu)成消化系腫瘤患者機(jī)體免疫微環(huán)境的基本狀態(tài)。
　　結(jié)論:
　　在未成熟樹突狀細(xì)胞系DC2.4中，過表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子Hlx，可以促進(jìn)IFN-γ的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，進(jìn)而促使樹突狀細(xì)胞成熟、IL-12分泌增加、吞噬能力下降、抗原提呈能力增強(qiáng)。能夠更有效的促進(jìn)同基因型來源的CD4+T細(xì)胞的分裂增殖。
　　Hlx表達(dá)水平與腦脊髓損傷介導(dǎo)的免疫炎癥有關(guān)，其可促進(jìn)損傷機(jī)體Th1細(xì)胞優(yōu)勢(shì)分化狀態(tài)，對(duì)脊髓二次免疫炎癥性損傷起著推波

17、助瀾的作用。在損傷的脊髓和腦組織中存在著細(xì)胞因子IFN-γ和Th1細(xì)胞特征性轉(zhuǎn)錄因子T-bet、Hlx的分布差異，可能因?yàn)榧顾钃p傷時(shí)發(fā)生了T細(xì)胞的浸入，使其特征性轉(zhuǎn)錄因子在脊髓的表達(dá)增加;而T細(xì)胞因未能及時(shí)浸入腦組織或浸潤腦組織較少，使轉(zhuǎn)錄因子T-bet、Hlx在腦組織中的表達(dá)水平?jīng)]有明顯改變，但Th1細(xì)胞特征性細(xì)胞因子IFN-γ仍在損傷腦組織表現(xiàn)為上調(diào)。
　　由于Hlx對(duì)胃腸組織發(fā)育起重要作用，因此我們檢測(cè)了Hlx在胃癌患者中表