氟致體外培養(yǎng)牛脾臟淋巴細(xì)胞凋亡機(jī)理的研究.pdf

1、氟過量攝入可引起機(jī)體多器官、多功能的損害，表現(xiàn)為以骨骼改變?yōu)橹鞯娜硇约膊?。在非骨相損害中，氟的免疫毒性日漸受到重視。本課題以體外培養(yǎng)牛脾臟淋巴細(xì)胞為研究對象，在培養(yǎng)液中加入不同濃度氟化鈉(NaF)，通過對牛脾臟淋巴細(xì)胞活性、細(xì)胞凋亡、抗氧化功能、DNA損傷、細(xì)胞內(nèi)游離Ca2+濃度、Caspase-3與Caspase-9活性及CaM、Caspase-3mRNA表達(dá)水平的檢測，旨在探討氟致牛脾臟淋巴細(xì)胞凋亡的機(jī)制。研究結(jié)果表明：

2、1.應(yīng)用臺盼藍(lán)拒染試驗(yàn)、四唑鹽比色法(MTT)、二硝基苯肼比色法檢測了牛脾臟淋巴細(xì)胞的活性和培養(yǎng)上清液中乳酸脫氫酶(LDH)活性。結(jié)果表明，氟對牛脾臟淋巴細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度(IC50)為1134.32μmol/L，氟能夠抑制體外培養(yǎng)牛脾臟淋巴細(xì)胞的活性，并對牛脾臟淋巴細(xì)胞具有毒性作用。 2.對染氟牛脾臟淋巴細(xì)胞內(nèi)一氧化氮(NO)、丙二醛(MDA)含量及一氧化氮合酶(NOS)、超氧化物歧化酶(SOD)與谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-

3、Px)活性的檢測。結(jié)果表明，氟能夠引發(fā)生脾臟淋巴細(xì)胞內(nèi)氧化脅迫，對免疫細(xì)胞具有毒性作用。 3.用吖啶橙/溴化乙錠(AO/EB)雙熒光染色熒光顯微鏡下、倒置顯微鏡下觀察不同濃度NaF誘導(dǎo)牛脾臟淋巴細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)變化及細(xì)胞生長情況。結(jié)果表明，氟能夠誘導(dǎo)牛脾臟淋巴細(xì)胞凋亡，且凋亡率具有劑量依賴性。 4.應(yīng)用瓊脂糖凝膠電泳、KCl-SDS沉淀法檢測氟對牛脾臟淋巴細(xì)胞DNA的損傷作用。結(jié)果表明，氟能夠引發(fā)淋巴細(xì)胞DNA損傷，并呈

4、現(xiàn)劑量效應(yīng)。 5.應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測牛脾臟淋巴細(xì)胞△ψm變化。結(jié)果表明，氟可通過引起牛脾臟淋巴細(xì)胞△ψm降低而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。 6.應(yīng)用半定量RT-PCR法和熒光探針法檢測細(xì)胞內(nèi)CaMmRNA表達(dá)水平和游離Ca2+濃度。結(jié)果表明，氟能夠引起牛脾臟淋巴細(xì)胞內(nèi)CaMmRNA表達(dá)水平下降，游離Ca2+濃度升高，干擾細(xì)胞Ca2+的轉(zhuǎn)運(yùn)，導(dǎo)致細(xì)胞鈣穩(wěn)態(tài)失衡而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。 7.應(yīng)用半定量RT-PCR方法檢測細(xì)胞Caspase

5、-3mRNA表達(dá)水平，比色檢測Caspase-3、Caspase-9活性。結(jié)果表明，牛脾臟淋巴細(xì)胞內(nèi)Caspase-3mRNA表達(dá)及Caspase-3、Caspase-9活性增加是氟引起牛脾臟淋巴細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵因素。 本研究以體外培養(yǎng)染氟牛脾臟淋巴細(xì)胞為研究對象，從細(xì)胞的形態(tài)、DNA損傷、酶活性及凋亡基因表達(dá)水平等角度入手，從分子水平上揭示了氟免疫毒性機(jī)制。該研究結(jié)果可為揭示氟致動物免疫細(xì)胞損傷和免疫毒性機(jī)制提供科學(xué)的理論基礎(chǔ)和