人體外周血淋巴細胞培養(yǎng)與染色體核型分析

1、<p><b>　　西南大學 </b></p><p>　　《細胞生物學自主實驗》課程論文</p><p>　　論文題目：人體外周血淋巴細胞培養(yǎng)與染色體核型分析</p><p><b>　　學院：生命科學學院</b></p><p><b>　　專業(yè)：生物科學</b>

2、</p><p>　　年級班級：2010級5班</p><p><b>　　校區(qū)編碼：北區(qū)</b></p><p>　　學號：222010317011128</p><p><b>　　姓名：陳建坤</b></p><p>　　二零一二年十二月四日</p>&l

3、t;p>　　人體外周血淋巴細胞培養(yǎng)與染色體核型分析</p><p>　　10級生科5班3組 陳建坤 學號：222010317011128</p><p>　　【摘要】：染色體是遺傳物質(zhì)的載體，它具有貯存和傳遞DNA、控制基因活動和調(diào)整基因重組的作用。本文著重介紹通過對人體外周血淋巴細胞培養(yǎng)與染色體核型分析，初步了解到對人體外周血淋巴細胞培養(yǎng)方法與人類體細胞染色

4、體核型分析的方法。該實驗采用人工離體培養(yǎng)的方法，采集人體外周血淋巴細胞，在加有植物血球凝集素（PHA，刺激小淋巴細胞轉(zhuǎn)化為淋巴母細胞而進行有絲分裂）的培養(yǎng)基中培養(yǎng)。經(jīng)過（72±2）恒溫培養(yǎng)，秋水仙素處理、低滲和固定，獲得大量有絲分裂中期細胞。最后經(jīng)過空氣干燥法制片，對人體外周血淋巴細胞進行染色體核型分析。</p><p>　　【關(guān)鍵字】：人體外周血淋巴細胞 染色體核型 人工離體培養(yǎng) &l

5、t;/p><p><b>　　一．引言:</b></p><p>　　染色體是遺傳物質(zhì)的載體，它具有貯存和傳遞DNA、控制基因活動和調(diào)整基因重組的作用。人類染色體核型分析是將人的一個體細胞有絲分裂中期的染色體，在技術(shù)的基礎(chǔ)上，按照染色體的大小和形態(tài)特征（主要根據(jù)著絲點位置），對染色體進行分組、排隊和配對。這對于探索人類遺傳病的發(fā)病機理，探討動物和植物的起源，以及物種間的親

6、緣關(guān)系等都具有重要意義。直到上世紀50年代，科學家對染色體本身的細致深入研究才成為可能。染色體組型分析是細胞遺傳學研究的基本方法，是研究物種演化、分類以及染色體結(jié)構(gòu)、形態(tài)與功能之間，人類G顯帶核型圖譜關(guān)系所不可缺少的重要手段。1952年徐道覺用低滲法使細胞膨脹，使染色體充分分散開來。1956年，Tjio等用秋水仙素使細胞分裂固定在分裂中期，增加了細胞分裂相。之后，有科學家建立了人體外周血培養(yǎng)法，使得染色體取材變得更加容易，大大推動了人類

7、對染色體的研究。</p><p>　　二．人體外周血淋巴細胞培養(yǎng)與染色體核型分析</p><p>　　1.實驗依據(jù)：1.1.細胞培養(yǎng)是在體外模擬體內(nèi)的生理環(huán)境，培養(yǎng)從機體中取出的細胞，并使之生存和生長的技術(shù)為細胞培養(yǎng)技術(shù)。要使細胞能在體外長期生長，必須滿足兩個基本要求：一是供給細胞存活所必需的條件，如適量的水、無機鹽、氨基酸、維生素、葡萄糖及其有關(guān)的生長因子、氧氣、適宜的溫度，注意外環(huán)境酸

8、堿度和滲透壓的調(diào)節(jié)。二是嚴格控制無菌條件。</p><p>　　1.2.染色體是組成細胞核的基本物質(zhì), 是基因的載體。 人類細胞遺傳學研究的主要對象是染色體。本實驗采用了微量全血培養(yǎng)技術(shù)，既方便又節(jié)省人力物力。在正常情況下, 人外周血中是沒有分裂相的, 只有在異常情況下才能發(fā)現(xiàn)。 植物血細胞凝集素(PHA) 是人類淋巴細胞有絲分裂的刺激劑,在 PHA 作用下, 原處于 G0期的淋巴細胞轉(zhuǎn)化為淋巴母細胞, 進而進行

9、有絲分裂。 利用 PHA 這一特性, 淋巴細胞經(jīng)過含有 PHA 培養(yǎng)液培養(yǎng), 在體外便可獲得豐富的含有絲分裂的生長活躍的細胞群體, 終止分裂中期的淋巴細胞, 經(jīng)過短期培養(yǎng)，秋水仙素的處理，低滲和固定，就可獲得大量的中期有絲分裂細胞。最后經(jīng)空氣干燥法制片，便可得到質(zhì)量較好的染色體標本。即可得到所需的人體染色體圖形。</p><p>　　染色體組型，又稱核型，是指將動物、植物、真菌等的某一個體或某一分類群（亞種、種、

10、屬等）的體細胞內(nèi)的整套染色體，按它們相對恒定的特征排列起來的圖像。核型模式圖，是指將一個染色體組的全部染色體逐個按其特征繪制下來，再按長短、形態(tài)等特征排列起來的圖像。</p><p>　　染色體組型分析就是通過對染色體標本和其照片進行測量、對比分析、配對、分組、排列，對各染色體的形態(tài)進行分析。在細胞遺傳學、現(xiàn)代分類學、生物進化和遺傳育種學等研究中，是重要的研究手段。</p><p>　　1

11、.3.對于任何一個染色體的基本形態(tài)特征來說，重要的參數(shù)有以下3個：</p><p>　?。?）相對長度=單條染色體的長度/(單倍體常染色體+X或Y染色體)的總長度×100%</p><p>　?。?）臂指數(shù)=長臂/短臂 （反映著絲粒位置的指數(shù)）</p><p>　?。?）著絲粒指數(shù)=短臂/整個染色體長度×100%（反映著絲粒位置的指數(shù)）</

12、p><p>　　人類體細胞的正常核型是含有23對染色體，共46條。其中22對是男女共有的染色體，一對為男女所不同的性染色體，男XY,女XX。</p><p>　　表-1 人類染色體組型</p><p>　　正常男性染色體核型 正常女性染色體核型</p><p>　　3、實驗儀器試劑及材料：&l

13、t;/p><p><b>　　3.1.材料：</b></p><p>　　人的靜脈外周血. （組內(nèi)選取男女各一名，取血樣）</p><p><b>　　3.2.試劑：</b></p><p>　　RPMI-l640培養(yǎng)粉 NaHCO3 NaCl PHA(植物血球凝集素) 肝素 青鏈霉素&l

14、t;/p><p>　　小牛血清 秋水仙素 95%酒精 冰乙酸 甲醇 甘油 Giemsa粉末</p><p><b>　　3.3.器材： </b></p><p>　　恒溫培養(yǎng)箱,電冰箱,高壓滅菌鍋,離心機,真空泵,分析天平,顯微鏡,超凈工作臺,注射器,離心管,培養(yǎng)瓶,試管架及試管,量桶,燒杯,酒精燈,抽濾瓶,G6型號細菌過濾漏

15、斗，染缸，滴管等。</p><p><b>　　4、實驗方法：</b></p><p>　　4.1.各種試劑及培養(yǎng)基的配制 </p><p>　　(1)RPMI-1640基礎(chǔ)培養(yǎng)基的配制：稱取RPMI-l640培養(yǎng)粉9.8g溶于1,000mL蒸餾水中,經(jīng)G6型號細菌過濾漏斗中0.22微米的濾膜抽濾后備用。使用前最好做熱源培養(yǎng)以確保實驗順利進行。

16、</p><p>　　(2)5%NaHCO3的配制：稱取5gNaHCO3,溶于100mL蒸餾水中,高壓滅菌備用. </p><p>　　(3)生理鹽水的配制：稱取0.85gNaCl溶于l00mL蒸餾水中高壓滅菌備用. </p><p>　　(4)PHA(植物血球凝集素)的配制：稱取PHA50mg配制成濃度為lmg/mL(生理鹽水配制)的溶液.由于PHA使用量較少,配

17、制時使用注射器式無菌過濾器,以減少藥品損失. </p><p>　　(5)肝素溶液的配制：40ml生理鹽水溶解粉末160mg（每mg含126單位），配制成500單位/ml，8磅15min滅菌。</p><p>　　(6)雙抗溶液的配制：將青鏈霉素用生理鹽水按效價單位配成l0萬單位/mL,配制過程要求使用注射器式無菌過濾器.</p><p>　　(7)秋水仙素溶液的配

18、制：用生理鹽水配制成濃度為40（微克/mL）秋水仙素溶液,使用注射器式無菌過濾器進行除菌操作. </p><p>　　(8)低滲液溶液的配制：稱取5.59gKCl溶于1000mL雙蒸餾水中,配制成溶液濃度為0.075mol/L的低滲液溶液.</p><p>　　(9)細胞培養(yǎng)基的配制：在每個培養(yǎng)瓶中加入RPMIl640基礎(chǔ)培養(yǎng)基4mL,小牛血清lmL,肝素3滴（0.03ml）,PHA4滴（

19、0.4 ml）, 加入雙抗5滴（0.05ml）,NaHCO3調(diào)pH至7.2～7.4.</p><p>　　（10）固定液的配制：9ml純酒精+3ml冰乙酸</p><p>　?。?1）Giemsa（吉姆斯）染液（不用配）</p><p>　　Giemsa原液配制：稱Giemsa粉末0.5g，加幾滴甘油研磨，再加入甘油（使加入的甘油總量為33ml）。56℃中保溫90～

20、120min。加入33ml甲醇，置棕色瓶中保存。</p><p><b>　　4.2實驗操作方法</b></p><p>　　1、實驗所用藥品及器皿的無菌處理 </p><p>　　(1) 實驗用的所有器皿,器具都必須按規(guī)定洗凈,高壓滅菌處理備用. </p><p>　　(2) 實驗用全部藥品都要經(jīng)高壓滅菌或過濾除菌處理

21、.具有生物活性的藥品要經(jīng)G6型號細菌過濾漏斗抽濾除菌,其它藥品可經(jīng)過高壓滅菌。</p><p>　　2.采取血樣：去校醫(yī)院取本組男生和女生各2份血樣。在無菌條件下，向含有3mlRPMI-1640培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中接種0.18 ml全血，輕輕搖勻。</p><p>　　3.血細胞培養(yǎng)：將4瓶裝有血細胞的培養(yǎng)瓶置于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)66～72h（在培養(yǎng)期間每天搖動兩次），終止培養(yǎng)前3～4h加入秋

22、水仙素15ml，使最終濃度為0.4～0.8ug/ml。</p><p>　　4.收集細胞：將培養(yǎng)瓶從溫箱取出，用吸管將貼壁細胞沖散均勻，按下表將液體分裝在相應的離心管中，以1000rpm/min離心8min，棄上清液。</p><p>　　5.低滲處理：先加入1ml 0.075mol/L KCl溶液，輕輕吹打，使細胞重懸，然后補加6ml KCl溶液，37℃低滲20min。（使紅細胞脹破，白

23、細胞脹大，染色體空間變大，易伸展，便于觀察）</p><p>　　6.預固定：沿管壁慢慢加入1ml新配carnoy氏固定液，輕輕吹打混勻，1000rpm/min離心8min，去上清液。</p><p>　　7.固定：沿管壁慢慢加入6ml固定液，固定兩分鐘后再吹打，用吸管輕輕地吹打，使細胞分散，固定20min，離心去上清夜。</p><p>　　8.重復固定：取上清液

24、，再重復進行7過程。</p><p>　　9.滴片：沉淀物中加入6滴固定液，用吸管吹打使其成為細胞懸液；用鑷子取預先冰凍的干凈載玻片，迅速滴上2～3滴細胞懸液，立即用嘴向同一方向吹氣，使細胞分散均勻，然后置酒精燈上微微加熱干燥（或空氣干燥）。</p><p>　　10.染色：滴有細胞懸液的載片反扣在染色板上，使片、板之間有一縫隙，將稀釋后的Giemsa染液滴在片隙中，染色20min（或放于

25、染缸中）；自來水沖洗，吹干。</p><p>　　11.鏡檢：在低倍鏡找到處于中期分裂相的細胞，然后在轉(zhuǎn)至高倍鏡下觀察.觀察時要使用推進器座標尺記錄分散良好的細胞位置，便于重新查找，選擇染色體分散好、長度適中、姐妹染色單體清楚的中期分裂相進行顯微觀察。人類每個體細胞有46條染色體，根據(jù)染色體的長度和著絲粒位置的不同，可以分成22對常染色體和一對性染色體，男子是46，XY；女子是46，XX。</p>

26、<p>　　12.染色體組型分析：</p><p>　　(1)在顯微鏡下找出染色體分散良好、長度適中、姐妹染色單體清楚的中期分裂相進行顯微拍攝。</p><p>　　(2)將顯微拍攝放大的照片上的一個細胞的全部染色體分別一條一條剪下。</p><p>　　(3)根據(jù)染色體的長短和形態(tài)特征進行同源染色體的目測配對。</p><p&g

27、t;　　(4)測量出每條染色體短壁和長臂長度，計算出各條染色體的相對長度、著絲粒指數(shù)、臂指數(shù)，記錄原始數(shù)據(jù)。</p><p>　　(5)根據(jù)測量數(shù)據(jù)校正目測配對排列結(jié)果，進行調(diào)整排列。</p><p>　　(6)把染色體按一定順序一對一對的排列，排列時注意短臂向上，長臂向下，性染色體單獨排列，最后把染色體貼成一完整的染色體核型圖。</p><p><b&

28、gt;　　(7)翻拍。</b></p><p><b>　　5．實驗結(jié)果及分析</b></p><p>　　5.1.本實驗采用國際標準，使用兩種方法，依照上表各指標分析染色體組型，擬圖，結(jié)</p><p><b>　　果如下</b></p><p>　　男性染色體核型 （PS）

29、 女性染色體核型 （PS）</p><p>　　男性染色體核型（手工） 女性染色體核型（手工）</p><p>　　5.2.數(shù)據(jù)處理：見下表 男性</p><p><b>　　女性：</b></p><p>　　5.3.根據(jù)上面的實

30、驗圖示以及實驗數(shù)據(jù)可知：論采用何種方式處理方式（PS或手工），均得到相同的人體染色體組型，人體正常細胞核型含46條染色體，相互配對成23對。其中22對為男女共有的常染色體。另一對男XY，女XX為男女所獨有的，決定性別的性染色體。</p><p>　　5.4.實驗細胞培養(yǎng)過程中，每個培養(yǎng)瓶中均出現(xiàn)血細胞凝集現(xiàn)象，定期的搖動可以將其分散。然而男1培養(yǎng)瓶由于搖動的時間以及次數(shù)比較少，出現(xiàn)了凝集成血塊狀的沉淀，但是并沒有

31、對實驗結(jié)果產(chǎn)生嚴重影響。在后期的試驗中仍可拍到很好地圖像,如上圖男性染色體核型(ps）所示.</p><p>　　5.5.根據(jù)實驗所拍到的圖像可得知，女2②號、男2②培養(yǎng)瓶所拍到的染色體的分散程度比其他培養(yǎng)瓶的較好。表明低滲的處理時間會對染色體的分散程度產(chǎn)生影響，低滲25min的效果比低滲20min的效果好。</p><p>　　5.6.相比其他組所拍到的染色體，我們組的染色體明顯較短。原

32、因是①其他組加入秋水仙素的時間比我們早，他們的染色體大多是處于分裂晚前期和早中期；②我們組加的秋水仙素的量比較多，對染色體產(chǎn)生了影響。</p><p>　　6．影響實驗的事項：</p><p>　　6.1.外周血的采集：采血接種時不要加入太多的肝素。肝素過多可能引致溶血和一些淋巴細胞轉(zhuǎn)化和分裂。接種時，若血液過少，獲得的淋巴細胞少；而接種過多，淋巴細胞增殖不良，染色體稀少。</p&g

33、t;<p>　　6.2.培養(yǎng)基：培養(yǎng)基的質(zhì)量在影響染色體質(zhì)量方面最為關(guān)鍵，從營養(yǎng)不良的培養(yǎng)基中獲得的細胞所制備的染色體質(zhì)量差，不利于染色體核型分析。</p><p>　　6.3. 細胞培養(yǎng)：細胞培養(yǎng)階段也是極為關(guān)鍵的一步，細胞的旺盛生長與培養(yǎng)時間、溫度、CO2濃度等條件。培養(yǎng)時間以（72±2）h為宜，時間過長或過多，得到的染色體質(zhì)量都不符合要求。淋巴細胞培養(yǎng)的適宜溫度為（36±0

34、.5）℃ ，偏離這一溫度范圍，細胞的正常代謝會受到影響，甚至死亡。 如果溫度高于37℃,細胞的生長速度減慢；如果溫度高于40℃ ，細胞受損，超過43℃，則導致細胞死亡。氣體是人體細胞培養(yǎng)生存必需條件之一，所需氣體主要有O2、CO2。CO2既是細胞代謝產(chǎn)物，也是細胞生長繁殖所需成分，它在細胞培養(yǎng)中的主要作用在于維持培養(yǎng)基的PH值。 大多數(shù)細胞的適宜PH為7.2～7.4,培養(yǎng)基的PH值也應調(diào)整到7.2～7.4偏離這一范圍對細胞培養(yǎng)將產(chǎn)生有害

35、的影響。 偏酸性時細胞發(fā)育不良，偏堿性時細胞會出現(xiàn)輕度固縮。培養(yǎng)箱的溫度和CO2 濃度應嚴格控制在(37 ±0.5）℃ 、5％ 以獲得良好的中期分裂相。</p><p>　　6.4. 秋水仙素與作用時間：秋水仙素作為細胞培養(yǎng)中的紡錘體阻斷劑，可使分裂象細胞停留在分裂中期而獲得大量分裂中期染色體以便于核型分析。加入秋水仙素的劑量、作用時間與處于分裂中期細胞數(shù)量、染色體長短密切相關(guān)。加入的秋水仙素過量、作用

36、時間過長，染色體濃縮，不利于分析；若加入的秋水仙素量不足、作用時間過短，則染色體細長或無染色體，同樣不利于核型分析。只有適量的秋水仙素與適量的作用時間，才能獲得較好的分裂象。</p><p>　　6.5. 離心力與低滲時間：將培養(yǎng)物收集到15 ml的離心管中，通過離心獲得需要的細胞。整個過程中，離心力的大小很關(guān)鍵。離心力過大會導致細胞之間粘連過緊，低滲時細胞不能被充分混勻，影響低滲效果。用滲透壓很低的鹽溶液或蒸餾

37、水處理活細胞，使得細胞長大而不破裂，使得最后制成的片子染色體充分散開。低滲處理的時間過長或過短，都不利于后期染色體的分散，一般以20～25min分鐘為宜。</p><p><b>　　【參考文獻】</b></p><p>　　1、李國珍：染色體及其研究方法. 科學出版社. 1985. 第170-176頁</p><p>　　2、劉國章等：198

38、7. 遺傳，9(3): 26-27.</p><p>　　3、陳心陶: 醫(yī)學寄生蟲學(修訂第二版).人民衛(wèi)生出版社. 1965.第330-333頁.</p><p>　　4、李紅燕，王金富． 禽類染色體組型研究進展【J】.畜牧生產(chǎn). 2006．15 (3 )： 25 -27.</p><p>　　5、吳艷萍. 核型異常與疾病關(guān)系的分析【J】.現(xiàn)代預防醫(yī)學． 2007