軀體感覺系統(tǒng)年齡相關(guān)性髓鞘病變及其在老年痛發(fā)病中的意義.pdf

1、研究背景：
　　世界發(fā)達(dá)國家和新的經(jīng)濟(jì)增長(zhǎng)體國家（如我國）都存在人口老齡化問題，老齡人群的快速增長(zhǎng)已經(jīng)為社會(huì)醫(yī)療和公共衛(wèi)生服務(wù)帶來了巨大挑戰(zhàn)。無法回避的事實(shí)是相當(dāng)比例的老年人正在經(jīng)歷著各種類型的疼痛。據(jù)調(diào)查，養(yǎng)老院里高達(dá)80％的老年人存在至少一項(xiàng)疼痛問題，超過40%的人正在經(jīng)歷難以忍受的疼痛。而老齡化過程本身也是各種類型疼痛的主要易感因素。研究顯示，有些慢性痛的發(fā)病率隨增齡而提高，如難治的頑固性外周神經(jīng)病理性痛（帶狀皰疹后神經(jīng)痛、

2、糖尿病性神經(jīng)痛）、中樞神經(jīng)病理性痛（如中樞中風(fēng)后疼痛）和痛性骨關(guān)節(jié)變性病等多發(fā)生在老年人，而青年人少見，提示老年痛具有特殊的生物學(xué)機(jī)制，但機(jī)制至今不清。最近我們實(shí)驗(yàn)室在新生、成熟和老化10幾個(gè)年齡大鼠的研究上發(fā)現(xiàn)，無論在外周神經(jīng)系統(tǒng)（PNS）還是在中樞神經(jīng)系統(tǒng)（CNS），粗大的有髓神經(jīng)纖維都最早出現(xiàn)變性樣改變，我們把這個(gè)現(xiàn)象叫做髓鞘病變（myelinopathy）。髓鞘病變組織病理上可被分為 I-III級(jí)，I級(jí)只累及髓鞘本身（如致密層解

3、開、空泡、崩解、斷裂），而 III級(jí)可累及軸突并導(dǎo)致其發(fā)生顯著的變性。本博士學(xué)位論文在以往研究的基礎(chǔ)上，重點(diǎn)觀察和分析了軀體感覺初級(jí)傳入神經(jīng)元的外周突（如坐骨神經(jīng)）和中樞突（脊髓后索）老化的年齡變化特點(diǎn)，然后探索髓鞘病變對(duì)脊髓背角（疼痛信息處理與加工的門戶）的影響，期望從髓鞘病變的分子和細(xì)胞機(jī)制上找到老年痛發(fā)生的身體易感因素。
　　研究目的：
　　1.觀察大鼠軀體感覺系統(tǒng)外周和中樞神經(jīng)纖維超微結(jié)構(gòu)的年齡相關(guān)性變化；
　

4、　2.檢測(cè)大鼠脊髓神經(jīng)纖維髓鞘相關(guān)蛋白表達(dá)水平的年齡相關(guān)性變化；
　　3.檢測(cè)大鼠脊髓小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞的年齡相關(guān)性活化狀態(tài)；
　　4.評(píng)價(jià)大鼠年齡對(duì)軀體感覺、軀體運(yùn)動(dòng)和模型大鼠痛行為的影響；
　　5.探討大鼠軀體感覺系統(tǒng)神經(jīng)纖維老化變性的可能分子機(jī)制。
　　研究意義：
　　應(yīng)用電鏡、免疫熒光等形態(tài)學(xué)方法，結(jié)合分子生物學(xué)技術(shù)和行為學(xué)手段，從軀體感覺系統(tǒng)神經(jīng)纖維髓鞘結(jié)構(gòu)的年齡相關(guān)性改變、膠質(zhì)細(xì)胞年齡相關(guān)

5、性活化、正常大鼠及神經(jīng)病理性痛模型大鼠年齡相關(guān)性痛行為變化和炎性因子在老化過程中的動(dòng)態(tài)改變等多個(gè)方面去探討老年痛的可能機(jī)制。希望能夠從老化相關(guān)髓鞘病變的發(fā)生發(fā)展中尋找老年痛發(fā)生的生物學(xué)風(fēng)險(xiǎn)因素。
　　實(shí)驗(yàn)方法：
　　本課題應(yīng)用透射電鏡技術(shù)觀察大鼠軀體感覺系統(tǒng)超微結(jié)構(gòu)的年齡相關(guān)性變化；應(yīng)用免疫學(xué)方法（免疫熒光和免疫印跡）檢測(cè)大鼠脊髓中髓鞘相關(guān)蛋白表達(dá)水平的年齡相關(guān)性變化和大鼠脊髓內(nèi)小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞的年齡相關(guān)性活化狀態(tài)；

6、應(yīng)用行為學(xué)手段評(píng)價(jià)大鼠軀體感覺、軀體運(yùn)動(dòng)的年齡相關(guān)性改變及年齡對(duì)疼痛模型大鼠痛行為的影響。最后為了探討大鼠年齡相關(guān)性軀體感覺、軀體運(yùn)動(dòng)改變的可能機(jī)制，我們應(yīng)用免疫標(biāo)記和免疫印跡的方法檢測(cè)不同年齡大鼠 HMGB1及其受體RAGE的表達(dá)水平。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
　　1.大鼠軀體感覺系統(tǒng)神經(jīng)纖維超微結(jié)構(gòu)的年齡相關(guān)性變化
　　大鼠軀體感覺系統(tǒng)超微結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)出顯著的年齡相關(guān)性改變。生后2月齡大鼠坐骨神經(jīng)和脊髓后索有髓神經(jīng)纖維結(jié)構(gòu)基本

7、完整，且基質(zhì)結(jié)構(gòu)電子密度均勻。而12月齡時(shí)，其中部分有髓神經(jīng)纖維發(fā)生了髓鞘病變。生后26月齡時(shí)，有髓神經(jīng)纖維的病變更加明顯，絕大部分髓鞘都出現(xiàn)了腫塊形成、異源性物質(zhì)沉積、髓鞘冗余、施-蘭切跡崩解、內(nèi)向或/和外向髓鞘褶皺、軸索擠壓變形等。最終累及軸突發(fā)生退行性改變（軸突變性）。此外，老齡時(shí)期，基質(zhì)成分丟失顯著，纖維間距離增大。坐骨神經(jīng)中無髓神經(jīng)纖維也發(fā)生了年齡相關(guān)性的病理改變。生后2個(gè)月大鼠坐骨神經(jīng)無髓神經(jīng)纖維結(jié)構(gòu)完整，呈現(xiàn)由施旺細(xì)胞單層

8、突起包裹的數(shù)根纖維為一組的神經(jīng)束狀結(jié)構(gòu)，而12月齡時(shí)，個(gè)別軸突中出現(xiàn)空泡樣變性，但還未累及施旺細(xì)胞。26月齡時(shí)，病理變化加劇，束內(nèi)的無髓纖維膜結(jié)構(gòu)破壞嚴(yán)重，單根纖維結(jié)構(gòu)不清，軸突內(nèi)有空泡，電子致密度異常增高。此月齡，施旺細(xì)胞發(fā)生變性壞死，進(jìn)而其包繞的無髓纖維發(fā)生整束的壞死，呈現(xiàn)“黑葡萄樣”結(jié)構(gòu)。脊髓后索是粗大的初級(jí)傳入有髓纖維進(jìn)入后形成的上行纖維束路，觀察顯示其存在與外周同樣的病理改變，少突膠質(zhì)細(xì)胞也出現(xiàn)變性樣改變。為了更好的對(duì)髓鞘結(jié)構(gòu)

9、的年齡相關(guān)性變化進(jìn)行定量分析，我們使用本實(shí)驗(yàn)室提出的病理分級(jí)方法，對(duì)神經(jīng)纖維病變進(jìn)行分級(jí)定量。結(jié)果提示，坐骨神經(jīng)中病變的有髓神經(jīng)纖維和無髓神經(jīng)纖維所占比例均隨年齡增長(zhǎng)顯著增加；脊髓后索中病變的有髓神經(jīng)纖維所占比例隨年齡增長(zhǎng)顯著增加。
　　2.大鼠脊髓中樞髓鞘相關(guān)蛋白表達(dá)水平的年齡相關(guān)性變化
　　大鼠脊髓中樞髓鞘相關(guān)蛋白表達(dá)水平呈現(xiàn)顯著的年齡相關(guān)性改變。2月齡大鼠脊髓后索髓鞘相關(guān)蛋白（O1、CNP、GalC、MOG等）依髓鞘結(jié)

10、構(gòu)呈現(xiàn)出完整的圓環(huán)狀。DAPI染色顯示后索內(nèi)細(xì)胞胞核均勻、散在分布。而老齡時(shí)期，髓鞘相關(guān)蛋白含量顯著下降，特別是MOG、CNP和GalC，DAPI陽性細(xì)胞核密度減少明顯，并出現(xiàn)了細(xì)胞核聚集的現(xiàn)象。對(duì)脊髓細(xì)胞骨架分子進(jìn)行標(biāo)記，結(jié)果顯示NF200的含量在老齡大鼠后索有小幅度的減少。用 MBP和NF200雙標(biāo)顯示，少突膠質(zhì)細(xì)胞的突起穿行于神經(jīng)纖維之間形成髓鞘，但老齡時(shí)的一個(gè)顯著特征是在MBP和NF200共標(biāo)記的纖維周圍常可見密集的小直徑細(xì)胞核

11、聚集，而聚集細(xì)胞中DAPI與MBP基本不共存，提示是非髓鞘形成細(xì)胞的核聚集所致。后續(xù)鑒定顯示，聚集的細(xì)胞核與GFAP不共存，但與Iba1有共存現(xiàn)象，提示聚集細(xì)胞是小膠質(zhì)細(xì)胞。對(duì)脊髓背根神經(jīng)節(jié)（DRG）細(xì)胞進(jìn)行分類標(biāo)記，結(jié)果顯示無論是DRG大細(xì)胞，亦或是中小細(xì)胞均未隨年齡的增長(zhǎng)發(fā)生數(shù)量上的改變。而對(duì)皮膚神經(jīng)纖維標(biāo)記后發(fā)現(xiàn)，神經(jīng)纖維數(shù)量在中、老齡大鼠皮膚顯著下降。同時(shí)，我們也檢測(cè)了坐骨神經(jīng)中髓鞘相關(guān)蛋白的表達(dá)情況。結(jié)果提示坐骨神經(jīng)中CNP、

12、PMP22和MBP的蛋白表達(dá)水平隨年齡增長(zhǎng)顯著下降；老齡時(shí)期細(xì)胞骨架標(biāo)記物（NF200）的表達(dá)水平也明顯的下降。
　　3.大鼠脊髓中樞小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞的年齡相關(guān)性活化狀態(tài)
　　大鼠脊髓小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞發(fā)生了年齡相關(guān)性的活化增強(qiáng)。青齡大鼠脊髓中Iba1陽性細(xì)胞很少，而在老齡時(shí)期，Iba1陽性細(xì)胞大量增加，小膠質(zhì)細(xì)胞活化明顯。與白質(zhì)區(qū)域（后索）相比，老齡大鼠灰質(zhì)內(nèi)（背角）小膠質(zhì)細(xì)胞活化更為顯著。后索中Iba1陽性

13、細(xì)胞密度老齡較青齡增加了約2倍，而在背角中，增加幅度接近4倍之多。且老化時(shí)，被激活的小膠質(zhì)細(xì)胞表現(xiàn)出胞體和突起變大。與小膠質(zhì)細(xì)胞相似，老齡時(shí)期星形膠質(zhì)細(xì)胞活化明顯，但分布灰、白質(zhì)間無明顯差別。
　　4.大鼠年齡對(duì)軀體感覺、軀體運(yùn)動(dòng)和疼痛反應(yīng)行為的影響
　　我們分別利用PWMT、PWTL評(píng)價(jià)大鼠軀體感覺變化，利用Rot-Rod評(píng)價(jià)軀體運(yùn)動(dòng)功能年齡相關(guān)性改變。結(jié)果提示老齡動(dòng)物（26月齡）械痛敏閾值顯著升高、熱痛敏潛伏期顯著延長(zhǎng)。

14、軀體運(yùn)動(dòng)功能評(píng)價(jià)結(jié)果與軀體感覺類似，老齡時(shí)期，大鼠運(yùn)動(dòng)功能發(fā)生顯著下降，在Rot-Rod上停留時(shí)間降低了幾十倍。但當(dāng)評(píng)價(jià)年齡對(duì)不同疼痛模型大鼠痛行為影響時(shí)發(fā)現(xiàn)，無論是炎性痛模型還是神經(jīng)損傷痛模型，老齡大鼠痛時(shí)程顯著延長(zhǎng)。綜合上述，提示老齡大鼠熱和機(jī)械痛閾均提高（對(duì)痛遲鈍），但炎性痛和神經(jīng)病理性痛更易持續(xù)慢性化。
　　5.老齡大鼠軀體感覺系統(tǒng)髓鞘病變的可能分子機(jī)制探索
　　在前述結(jié)果的基礎(chǔ)上，我們認(rèn)為神經(jīng)系統(tǒng)髓鞘和軸索發(fā)生崩解

15、破壞后產(chǎn)生的物質(zhì)會(huì)激活小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞，產(chǎn)生免疫學(xué)反應(yīng)，惡化原有損傷，引起一系列痛行為。因此檢測(cè)了晚期炎癥因子 HMGB1及其受體表達(dá)的年齡相關(guān)性變化。結(jié)果提示，HMGB1及其受體 RAGE在中、老齡動(dòng)物脊髓后索、背角中顯著高表達(dá)。與其高表達(dá)同時(shí)發(fā)生的還有膠質(zhì)細(xì)胞的大量活化。與中樞神經(jīng)系統(tǒng)類似，HMGB1在坐骨神經(jīng)中的表達(dá)也具有年齡相關(guān)性，老齡時(shí)期顯著增高3倍以上。RAGE在老齡時(shí)期的表達(dá)也增高了約20%。
　　結(jié)論：

16、r>　　1.髓鞘結(jié)構(gòu)的病理改變具有年齡相關(guān)性，隨年齡增長(zhǎng)其破壞程度不斷加重。提示在老化過程中，神經(jīng)系統(tǒng)中髓鞘可能是最易受累的組織結(jié)構(gòu)，同時(shí)也可能是最主要的老化作用靶點(diǎn)。
　　2.髓鞘相關(guān)蛋白在老齡時(shí)期顯著表達(dá)下調(diào)，使得髓鞘板層結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性遭到破壞，這可能是髓鞘結(jié)構(gòu)出現(xiàn)年齡相關(guān)性病理改變的物質(zhì)基礎(chǔ)。
　　3.正常大鼠老齡化過程伴隨機(jī)械痛刺激閾值升高和熱痛刺激潛伏期顯著延長(zhǎng)，提示痛敏感性降低，但老齡化可以延長(zhǎng)痛反應(yīng)的時(shí)程，提示老

17、齡大鼠疼痛更易持續(xù)慢性化。
　　4.小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞在老化時(shí)均出現(xiàn)活化增強(qiáng)，且在出現(xiàn)退行性改變的髓鞘旁有小膠質(zhì)細(xì)胞的聚集。膠質(zhì)細(xì)胞的激活會(huì)誘發(fā)一系列炎性反應(yīng)，導(dǎo)致脊髓處于一種敏化狀態(tài)，這可能是導(dǎo)致疼痛慢性化的重要機(jī)制之一。
　　5.老化過程中脊髓后索及背角中 HMGB1及其受體 RAGE表達(dá)大量增加，這可能是導(dǎo)致膠質(zhì)細(xì)胞活化的重要分子機(jī)制。
　　6.老齡動(dòng)物外周皮膚神經(jīng)纖維終末(PGP9.5)和熱傷害性感受器(