sjTREC與年齡相關(guān)性及其法醫(yī)學(xué)意義的初步探討.pdf

1、在法醫(yī)物證實(shí)踐中,當(dāng)法醫(yī)物證檢材如血液標(biāo)本等不具備形態(tài)學(xué)信息時(shí),根據(jù)分子生物學(xué)的方法可得到與年齡相關(guān)的一些有效信息。已有研究提出,多種生物學(xué)指標(biāo)如端粒DNA限制性酶切片段(TRF)長(zhǎng)度、線粒體DNA4977bp片段缺失程度、DNA甲基化水平等,均與個(gè)體年齡與衰老密切相關(guān),可能是法醫(yī)學(xué)年齡推斷中的有效指標(biāo)。目前,以上與個(gè)體年齡及衰老相關(guān)的生物學(xué)指標(biāo)在法醫(yī)學(xué)年齡推斷中的應(yīng)用研究分別取得了不同程度的進(jìn)展,但大多數(shù)仍處于實(shí)驗(yàn)階段,主要的問(wèn)題是分

2、子生物學(xué)的觀測(cè)指標(biāo)易受環(huán)境、遺傳和疾病等的影響,存在著人群和組織器官的差異等；單一指標(biāo)與年齡之間缺乏精確的定量關(guān)系。鑒于此,法醫(yī)年齡推斷研究組(Study Group on Forensic Age Diagnostics)提出,對(duì)于每一份檢材,盡可能同時(shí)使用三種不同的非形態(tài)學(xué)的生物指標(biāo),以提高法醫(yī)物證檢材年齡推斷的準(zhǔn)確性。因此,尋找更多與年齡相關(guān)性高、影響因素少的新指標(biāo),建立標(biāo)準(zhǔn)化與系統(tǒng)化的檢測(cè)方法,對(duì)提高生物檢材進(jìn)行年齡推斷的準(zhǔn)確性

3、具有重要的意義。
　　 隨著免疫學(xué)的長(zhǎng)足發(fā)展,免疫系統(tǒng)結(jié)構(gòu)和功能的增齡性變化規(guī)律以及在衰老過(guò)程中的作用也逐漸受到了研究者的普遍關(guān)注。作為中樞免疫器官,胸腺的增齡性功能退化是免疫系統(tǒng)在增齡和衰老過(guò)程中最突出的改變。定量分析外周血中特異的基因重排刪除產(chǎn)物-信號(hào)結(jié)合T細(xì)胞受體重排刪除環(huán)(Signal—joint Tcell recepter rearrangement excision circles,sjTRECs)水平是目前檢測(cè)胸

4、腺功能水平的可靠方法。研究證實(shí),人外周血sjTRECs水平隨增齡按一定的規(guī)律下降,有可能是年齡推斷中的理想新指標(biāo)。本課題以漢族健康無(wú)關(guān)個(gè)體為研究對(duì)象,擬建立一種簡(jiǎn)便、靈敏、特異、重復(fù)性好的實(shí)時(shí)熒光定量檢測(cè)人外周血siTREC含量方法,用于構(gòu)建正常人sjTREC水平的數(shù)據(jù)庫(kù),為客觀評(píng)價(jià)胸腺輸出功能提供實(shí)驗(yàn)依據(jù),并初步評(píng)價(jià)外周血sjTREC含量在年齡推斷中的潛在應(yīng)用價(jià)值。
　　 本研究主要包括以下三個(gè)部分:
　　 第一部分:

5、實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)sjTREC方法學(xué)建立
　　 目的:建立并優(yōu)化實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)人siTREC基因的方法。
　　 方法:設(shè)計(jì)并合成人sjTREC特異性引物與探針,使用TA克隆載體構(gòu)建人sjTREC標(biāo)準(zhǔn)品,建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。優(yōu)化實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)體系及熱循環(huán)參數(shù),并對(duì)所建立的實(shí)時(shí)定量PCR方法的特異性、靈敏度以及重復(fù)性進(jìn)行方法學(xué)評(píng)價(jià)。
　　 結(jié)果:基因組DNA經(jīng)實(shí)時(shí)定量擴(kuò)增后,可見(jiàn)清晰的擴(kuò)增曲線,而陰性對(duì)照(

6、雙蒸水)未見(jiàn)明顯擴(kuò)增曲線。成功構(gòu)建了人sjTREC的重組質(zhì)粒作為標(biāo)準(zhǔn)品,建立了標(biāo)準(zhǔn)曲線,所得標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率為-3.544,相關(guān)系數(shù)為0.999189,PCR反應(yīng)動(dòng)力學(xué)范圍達(dá)6個(gè)log值(101-106),檢測(cè)下限為lOcopies；穩(wěn)定性檢測(cè)中,三種濃度不同的標(biāo)準(zhǔn)品的批內(nèi)變異和批間變異分別為0.09％、0.77％、1.68％和0.54％、1.88％、1.83％,均小于2％。
　　 結(jié)論:建立的實(shí)時(shí)熒光sjTREC定量方法對(duì)目的基因

7、DNA拷貝數(shù)進(jìn)行PCR反應(yīng)線性范圍廣、敏感性高、穩(wěn)定性好,可滿足后續(xù)實(shí)驗(yàn)的要求。
　　 第二部分:實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)正常人外周血sjTREC含量的研究
　　 目的:本研究利用第一部分試驗(yàn)中建立的sjTREC定量檢測(cè)方法,對(duì)各年齡組正常人外周血sjTREC的含量進(jìn)行分析,初步建立正常人TRECs水平的數(shù)據(jù)庫(kù)。
　　 方法:使用試劑盒或酚/氯仿法提取收集的246例各年齡組健康人外周血基因組DNA樣本,利用第一部分

8、試驗(yàn)中建立的sjTREC定量檢測(cè)方法,在ABI7500 PCR儀上實(shí)時(shí)擴(kuò)增檢測(cè)各年齡組正常人外周血樣本中sjTREC片段,按照文獻(xiàn)介紹的方法計(jì)算每毫升血液中所含的sjTREC拷貝數(shù)(sjTREC/ml),結(jié)果取對(duì)數(shù)值。sjTREC含量與年齡的關(guān)系作相關(guān)分析；各年齡組性別差異作t檢驗(yàn)。
　　 結(jié)果:246例健康人外周血樣本按照年齡分為14組(每隔5歲為1組)。sjTREC定量結(jié)果表明,外周血sjTREC水平隨年齡增長(zhǎng)而逐漸下降,與

9、年齡呈顯著負(fù)性相關(guān)(r=0.8323,p<0.001),下降呈不均衡趨勢(shì):10～14組與15～19組的LogsjTREC/mL值差值最大,15～54歲之間各組檢測(cè)值相差均較小,55～組以上與50～54組差值又相對(duì)較大。對(duì)0～14歲、15～54歲、55～歲三組進(jìn)行方差分析,顯示三組間有顯著性差異(p<0.001)；均值多重比較結(jié)果(LSD檢驗(yàn))表明0～14歲與15～54歲組、15～54歲與55～歲組、0～14歲與55～歲組間的均值均有顯著

10、性差異(p<0.0001)；各年齡組男、女性外周血sjTREC水平均無(wú)顯著性差異(p>0.05)。定量結(jié)果受DNA抽提方法的影響。
　　 結(jié)論:使用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法,分析并提供了正常人各年齡組外周血中sjTREC含量,初步建立了正常人sjTREC水平的數(shù)據(jù)庫(kù),為客觀評(píng)價(jià)胸腺輸出功能提供了依據(jù)。由于使用單一的外參照,定量結(jié)果受DNA抽提效率的影響,因此有必要同時(shí)應(yīng)用內(nèi)標(biāo)管家基因來(lái)標(biāo)化結(jié)果并修正核酸抽提過(guò)程造成的目的基因拷貝數(shù)

11、的變化,以提高檢測(cè)的準(zhǔn)確性。
　　 第三部分:人外周血sjTREC水平在年齡推斷應(yīng)用中的初步研究
　　 目的:探討外周血sjTREC在年齡推斷應(yīng)用中的潛在價(jià)值。
　　 方法:選擇人TATA盒結(jié)合蛋白(TATA box binding protein,TBP)基因作為內(nèi)參基因,設(shè)計(jì)并合成人TBP特異性引物與探針,使用TA克隆載體構(gòu)建人TBP標(biāo)準(zhǔn)品,建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。使用建立的實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)系統(tǒng)對(duì)提取的248例各

12、年齡組健康人外周血樣本DNA中sjTREC和內(nèi)參基因TBP進(jìn)行定量檢測(cè),計(jì)算sjTREC與TBP的平均Ct值,并計(jì)算sjTREC/TBP比值,結(jié)果取對(duì)數(shù)值,以log(sjTREC/TBP)表示。log(sjTREC/TBP)值與年齡作相關(guān)及回歸分析；各年齡組性別差異作t檢驗(yàn)。
　　 結(jié)果:248例外周血log(sjTREC/TBP)值含量隨年齡增長(zhǎng)逐漸下降(r=-0.8177)；0～14歲內(nèi)外周血siTREC水平隨增齡下降的速度

13、較慢,14歲(青春期)開(kāi)始下降速度加快,與胸腺開(kāi)始萎縮的時(shí)間一致,之后在相當(dāng)長(zhǎng)的一段時(shí)間內(nèi)下降速度較緩,55歲開(kāi)始又開(kāi)始加快下降。對(duì)0～14歲、15～54歲及55～歲三組進(jìn)行方差分析(LSD檢驗(yàn)),顯示有顯著性差異(p<0.0001)；均值多重比較結(jié)果(LSD檢驗(yàn))表明0～14歲與15～54歲組、15～54歲與55～歲組、0～14歲與55～歲組間的均值均有顯著性差異(p

14、異(p>O.05)。得到推斷年齡的回歸方程為:Y=-24.921x-39.932±10.47(Y:供體年齡,歲；X:log(sjTREC/TBP)；±10.47:標(biāo)準(zhǔn)誤)；在所有被檢測(cè)的248例樣本中,162例(～66.0％)的年齡推測(cè)值與實(shí)際年齡誤差在10歲之內(nèi),其準(zhǔn)確率與文獻(xiàn)報(bào)道的利用TRF長(zhǎng)度推斷個(gè)體年齡的相似(49.5％的年齡實(shí)際值與推測(cè)值之間誤差小于10歲)。定量結(jié)果受DNA抽提效率的影響小。
　　 結(jié)論:使用內(nèi)參照基