雌激素對海馬神經(jīng)元癇樣放電及大鼠癲癇發(fā)作的影響及機制研究和培養(yǎng)基酚紅最佳濃度的探討.pdf

1、癲癇是一種常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病，誘發(fā)因素繁多，發(fā)病機制至今尚未完全闡明。在臨床工作中，部分女性患者的癲癇發(fā)作具有與其月經(jīng)周期密切相關的特點，在特定的月經(jīng)時相發(fā)作頻繁且藥物治療效果欠佳，稱之為經(jīng)期癲癇。目前認為這種類型的癲癇與體內雌激素濃度改變密切相關，但雌激素在經(jīng)期癲癇中所扮演的角色極具爭議性，既顯示出促癲癇發(fā)作的作用，同時也存在抑制癲癇的證據(jù)。根據(jù)各家之長我們大膽猜測:雌激素對癲癇的發(fā)作具有雙向調節(jié)作用，其作用劑量可能就是關鍵性因素

2、。那么究竟雌激素的濃度變化到怎樣的程度會引起癲癇發(fā)作的改變呢？這樣的變化是否能夠在細胞學上找到直觀的證據(jù)呢？
　　于是我們將實驗設計的重點直接放在了體外培養(yǎng)海馬神經(jīng)元的細胞膜動作電位的變化上。作為培養(yǎng)環(huán)境pH指示劑的酚紅，具有一定的模擬雌激素生物活性的作用，其是否也可以影響神經(jīng)元電活動，這種影響可以直接忽略不計嗎？一直以來我們習以為常使用的pH指示劑是否具有其他的功能？當有具體的研究要求時何為最佳的酚紅濃度？
　　海馬組織是

3、癲癇發(fā)病的關鍵結構，海馬神經(jīng)元的異常放電之于癲癇猶如竇房結之于心臟般會產(chǎn)生生物放電的級聯(lián)反應。那么雌激素濃度的改變對于海馬神經(jīng)元的異常放電會有怎樣的作用呢？這種作用是如何表現(xiàn)的又有怎樣的影響昵？是否通過常見的激素-受體機制發(fā)揮了生物學效應呢？
　　為解答這種種的疑問，我們展開了大量的細胞電生理實驗，以期能夠為這樣關鍵性的問題提供一些解答的方向。
　　第一部分:培養(yǎng)基pH指示劑酚紅最佳濃度的探討
　　目的:研究酚紅對培養(yǎng)

4、海馬神經(jīng)元異常放電的作用及其機制。方法:體外培養(yǎng)海馬神經(jīng)元，分別給予不同濃度的酚紅(0，10，21.5，30，60，100，200μM)與神經(jīng)元共同孵育14天，使用電生理膜片鉗技術記錄神經(jīng)元自發(fā)動作電位;30μM酚紅與雌激素非特異性受體拮抗劑ICI182780，與神經(jīng)元共同孵育14天，使用電生理膜片鉗技術記錄神經(jīng)元自發(fā)動作電位。結果:神經(jīng)元異常放電比例（癇樣放電神經(jīng)元/記錄神經(jīng)元總數(shù)，下同）:0μ M(84％，16/19);10μM(6

5、0％，12/20);21.5μ M(21％,5/24);30μM(9.5％,2/21);60μ M(43％,3/7);100μ M(53％，9/17);200μ M(83％，10/12)。30μM組神經(jīng)元異常放電比例相對于0、10、60、100、200μM各組明顯降低（p＜0.01）。神經(jīng)元異常放電頻率:0μM(0.024±0.005Hz, n=19);10μ M(0.006±0.002Hz, n=20);21.5μ M(0.007±0

6、.003Hz, n=24);30μ M(0.001±0.001Hz, n=21);60μ M(0.015±0.008Hz, n=7);100μ M(0.01±0.004Hz, n=17);200μ M(0.028±0.011Hz, n=12)。30μ M組神經(jīng)元異常放電頻率相對于0、10、21.5、60、100、200μ M各組明顯降低（p＜0.01）。當30μ M酚紅與ICI182780共同孵育14天后，30μ M組神經(jīng)元異常放電比例

7、及頻率為(9.5％;0.001±0.001Hz)，ICI182780組神經(jīng)元異常放電比例及頻率為(80％;0.024±0.006Hz)。ICI182780組神經(jīng)元異常放電比例及頻率較30μ M組明顯增高（p＜0.01）。結論:酚紅對培養(yǎng)海馬神經(jīng)元的異常癇樣放電同樣具有劑量依賴性U-形調節(jié)作用，且30μ M酚紅對培養(yǎng)神經(jīng)元異常癇樣放電的抑制作用是通過雌激素受體實現(xiàn)的。
　　第二部分:雌激素及其亞受體在培養(yǎng)海馬神經(jīng)元中的作用及其機制研

8、究
　　目的:從細胞模型出發(fā)，研究雌激素及其亞受體在神經(jīng)元異常放電中的作用及機制。方法:1.體外培養(yǎng)海馬神經(jīng)元，經(jīng)過14天神經(jīng)元發(fā)育成熟后，給予不同劑量的雌激素(0.1，0.3，1ng/ml)以及酒精溶劑(0.002％)作為對照，與神經(jīng)元共孵育3天，使用電生理膜片鉗技術，記錄神經(jīng)元自發(fā)動作電位。2.自體外培養(yǎng)海馬神經(jīng)元第一天開始，給予不同濃度的雌激素(0.03，0.1，0.3，1ng/ml)及酒精溶劑(0.002％)對照，與神經(jīng)元

9、共孵育14天后記錄神經(jīng)元自發(fā)動作電位。3.自培養(yǎng)第一天開始，將雌激素0.1ng/ml分別與不同濃度的雌激素受體拮抗劑MPP-D(ERα受體拮抗劑)(100，10，1nM)以及PHTPP（ERβ受體拮抗劑）(100，10，1nM)共同作用，14天后記錄神經(jīng)元白發(fā)動作電位。4.白培養(yǎng)第一天開始，將雌激素1ng/ml分別與雌激素受體拮抗劑MPP-D(100nM)以及PHTPP(100nM)共同作用，14天后記錄神經(jīng)元自發(fā)動作電位。結果:1.海

10、馬神經(jīng)元培養(yǎng)14天后，酒精及不同濃度雌激素處理3天，神經(jīng)元異常放電比例:酒精組(73％，22/30);雌激素0.1ng/m1(13％,3/23);0.3ng/ml(37％,11/30);1ng/ml(65％,13/20)。0.1ng/ml組相對酒精組、1ng/ml組明顯抑制神經(jīng)元異常放電比例(p＜0.01)。神經(jīng)元異常放電頻率:酒精組(0.019±0.005Hz，n=30);雌激素0.1ng/ml(0.007±0.007Hz, n=23

11、);0.3ng/ml(0.0079±0.003Hz, n=30);1ng/ml(0.037±0.016Hz，n=20)。0.1ng/ml組相對酒精組、1ng/ml組明顯抑制神經(jīng)元異常放電頻率（p＜0.01）。2.酒精及不同劑量雌激素作用于培養(yǎng)神經(jīng)元14天，神經(jīng)元異常放電比例:酒精組(80％，12/15);雌激素0.03ng/ml(47％，8/17);0.1ng/ml(24％，4/17);0.3ng/ml(56％，15/27);1ng/m

12、l(94％，15/16)。0.1ng/ml組相對其余各組明顯抑制神經(jīng)元異常放電比例（p＜0.01)。神經(jīng)元異常放電頻率:酒精組(0.016±0.003Hz, n=15);雌激素0.03ng/ml(0.04±0.018Hz, n=17);0.1ng/ml(0.004±0.002Hz, n=17);0.3ng/ml(0.01±0.004Hz, n=27);1ng/ml(0.034±0.007Hz，n=16)。雌激素0.1ng/ml組相對酒精

13、組、0.03ng/ml、1ng/ml組明顯抑制神經(jīng)元異常放電頻率（p＜0.01)。3.0.1ng/ml組雌激素，分別與不同濃度的MPP-D(100，10，1nM)以及PHTPP(100，10，1nM)共同作用于培養(yǎng)海馬神經(jīng)元，當100nM的MPP-D及PHTPP分別與0.1ng/ml雌激素作用，MPP-D組及PHTPP組神經(jīng)元異常放電比例及頻率無差異(MPP-D:80％，0.046±0.011Hz; PHTPP:89％，0.069±0.

14、016Hz)，較雌激素組(24％，0.004±0.002Hz)明顯升高(p＜0.01)。當MPP-D及PHTPP濃度為10nM時，MPP-D組神經(jīng)元放電比例及頻率(14％，0.004±0.004Hz)與雌激素組(24％，0.004±0.002Hz)無變化，而PHTPP組神經(jīng)元放電比例及頻率(83％，0.025±0.009Hz)較雌激素組明顯升高（p＜0.01)。當MPP-D及PHTPP濃度為1nM時，MPP-D組神經(jīng)元放電比例及頻率(1

15、1％，0.003±0.002Hz)與雌激素組(24％，0.004±0.002Hz)無變化，而PHTPP組神經(jīng)元放電比例及頻率(67％，0.052±0.029Hz)較雌激素組明顯升高（p＜0.01)。4.1ng/ml雌激素，分別與MPP-D(100nM)以及PHTPP(100nM)共同作用于培養(yǎng)海馬神經(jīng)元，實驗結果顯示，MPP-D組神經(jīng)元放電比例及頻率(20％，0.003±0.002Hz)明顯低于1ng/ml雌激素組(94％，0.034±

16、0.007Hz)(p＜0.01)，而PHTPP組神經(jīng)元放電比例及頻率(80％，0.04±0.015Hz)與1ng/ml雌激素組相比無變化。結論:不論是雌激素短期作用（3天），還是長期作用（14天），雌激素對神經(jīng)元異常癇樣放電的比例及頻率都具有劑量依賴性U-形調節(jié)作用，既具有抑制神經(jīng)元異常癇樣放電，也存在促進神經(jīng)元異常癇樣放電的作用，0.1ng/ml作用劑量是關鍵性的轉折點。雌激素不同的亞受體在神經(jīng)元異常癇樣放電中具有不同的作用，ERα對

17、神經(jīng)元異常癇樣放電起到促進作用，而ERβ則起到抑制性作用。
　　第三部分雌激素對大鼠癲癇發(fā)作的影響及其機制研究
　　目的:從癲癇動物模型出發(fā)，研究雌激素及其亞受體在至癇大鼠行為學中的作用及機制。方法:1.成年雌性SD大鼠陰道涂片確定有2個正常生理周期后行雙側卵巢摘除，術后飼養(yǎng)1周予以側腦室埋管，埋管后一周隨機分為去勢埋管對照組，雌激素組（側腦室注射雌激素0.75ng×3天），與雄性大鼠組及動情期大鼠組均使用PTZ(40mg/

18、kg)至癇。根據(jù)Racine分級標準，觀察至癇后大鼠發(fā)作行為。2.成年雌性SD大鼠側腦室埋管，一周后隨機分為MPP-D組以及PHTPP組，分別側腦室注射MPP-D(100nM)和PHTPP(100nM)大于3天，比較動情期大鼠癲癇發(fā)作。結果:1.雄鼠，去勢雌鼠，動情期雌鼠以及去勢+雌激素(0.75ng×3天)組行為學評分分別為:3.5±1.0(n=10)，0.143±0.143(n=7)，5.4±1.0(n=9)，4.7±0.8(n=7

19、)。去勢雌鼠發(fā)作強度較其余各組明顯降低(p＜0.01)。2.動情期組，動情期+MPPD組以及動情期+PHTPP組行為學評分分別為:5.4±1.0(n=9)，1.9±1.1(n=8)，3.1±1(n=8)。動情期+MPP-D組較動情期組大鼠癲癇發(fā)作強度明顯下降（p＜0.05)。結論:動物學實驗結果提示，雌激素對癲癇發(fā)作具有調節(jié)作用，其中ERβ可能起到抑制癲癇發(fā)作的作用。
　　結論
　　1.酚紅對培養(yǎng)神經(jīng)元的異常癇樣放電具有劑量

20、依賴性U-形調節(jié)作用，這種抑制作用是通過雌激素受體實現(xiàn)的。目前培養(yǎng)基中的酚紅濃度并非培養(yǎng)神經(jīng)元的最佳濃度。
　　2.體外培養(yǎng)海馬神經(jīng)元，無論是短期作用（3天），還是長期作用（14天），雌激素均顯示出對培養(yǎng)海馬神經(jīng)元異常癇樣放電的劑量依賴性U-形調節(jié)作用。
　　3.雌激素不同亞受體，在培養(yǎng)海馬神經(jīng)元異常癇樣放電中起到不同的作用，ERα對神經(jīng)元異常癇樣放電具有促進作用，ERβ則具有抑制性作用。
　　4.動物學實驗顯示，雌激