癲癇損傷機(jī)制的探討及依達(dá)拉奉對(duì)海人酸致癇大鼠海馬神經(jīng)元的保護(hù)作用.pdf

1、癲癇(epilepsy)是一組由已知或未知病因所引起，腦部神經(jīng)元高度同步化，且常具自限性的異常放電所導(dǎo)致，以反復(fù)發(fā)作性、短暫性、通常為刻板性的中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能失常為特征的綜合征。目前癲癇的治療主要靠藥物控制癇性發(fā)作，抑制致癇區(qū)神經(jīng)元的異常放電，從而減輕神經(jīng)元的繼發(fā)性損傷。依達(dá)拉奉(edaravone)是一種新型自由基清除劑，它能夠清除腦梗塞周?chē)毖氚祹Яu自由基、抑制脂質(zhì)過(guò)氧化，從而抑制腦細(xì)胞的損傷和凋亡，對(duì)腦血管病缺血缺氧導(dǎo)致的神經(jīng)元

2、損傷具有明顯的保護(hù)作用。 第一部分海人酸癲癇模型的制作方法： 1.動(dòng)物模型 成年健康雄性Wistar大鼠18只，體重260±20g，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分為2大組：(1)假手術(shù)組(2)模型組 2.腦電圖 大鼠麻醉后固定于立體定向儀上，放置深部電極，待大鼠清醒后，按上述分組制作模型，描記腦電圖。 3.大鼠行為學(xué)觀察大 鼠海馬腹后部CA3區(qū)注射KA后，觀察癲癇發(fā)作情況，并依據(jù)Racine六級(jí)癲癇發(fā)作

3、評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)KA致癇大鼠發(fā)作進(jìn)行分級(jí)，按實(shí)驗(yàn)要求將大鼠分入K1和K2組。 4 大鼠海馬CA1、CA3區(qū)及門(mén)區(qū)(CA4)組織形態(tài)學(xué)觀察大鼠于注藥或假手術(shù)后7天斷頭取腦，石蠟切片進(jìn)行硫堇染色，光學(xué)顯微鏡下觀察注藥對(duì)側(cè)(左側(cè))海馬CA1、CA3區(qū)及門(mén)區(qū)組織形態(tài)，并對(duì)其組織學(xué)改變進(jìn)行分級(jí)(0級(jí)：無(wú)神經(jīng)元死亡；Ⅰ級(jí)：散在神經(jīng)元死亡；Ⅱ級(jí)：成片的神經(jīng)元死亡；Ⅲ級(jí)：幾乎全部的神經(jīng)元死亡)，取左側(cè)等級(jí)作為統(tǒng)計(jì)值。高倍鏡下計(jì)數(shù)海馬CA1、CA3區(qū)

4、每1mm區(qū)段內(nèi)細(xì)胞膜完整、胞核飽滿(mǎn)、核仁清晰的錐體細(xì)胞數(shù)目，每張切片取左側(cè)海馬計(jì)數(shù)3個(gè)區(qū)段平均數(shù)為神經(jīng)元密度(Neuronaldensity，ND)。本實(shí)驗(yàn)取注射對(duì)側(cè)海馬作為研究對(duì)象。 結(jié)果: 1.大鼠行為學(xué)表現(xiàn)sham組大鼠行為無(wú)異常。 2.腦電圖 大鼠發(fā)作期腦電圖顯示明顯放電，為棘波、尖波、棘-慢綜合波、尖-慢綜合波，sham組大鼠腦電圖無(wú)明顯異常。 3.大鼠海馬CA1、CA3及門(mén)區(qū)(CA4)組

5、織形態(tài)學(xué)改變結(jié)果顯示，硫堇染色后sham組和K1組(小劑量海人酸注射組)對(duì)側(cè)海馬無(wú)明顯損傷，組織學(xué)分級(jí)多為0～Ⅰ級(jí)，海馬CA1、CA3區(qū)及門(mén)區(qū)細(xì)胞無(wú)缺失，排列整體，形態(tài)完整，胞核飽滿(mǎn)，核仁清晰，尼氏體豐富，細(xì)胞有突起。ND值sham組CA1和CA3分別為198±20.62和212±30.14；K1組CA1和CA3分別為186±19.45和208±27.73。K2組大鼠海馬神經(jīng)元可見(jiàn)明顯損傷，表現(xiàn)為CA1、CA3及門(mén)區(qū)細(xì)胞缺失、排列紊亂，

6、胞質(zhì)濃縮、深染，細(xì)胞形態(tài)有典型的多角形變?yōu)槿切位虿灰?guī)則型，殘存的錐體細(xì)胞周?chē)梢?jiàn)較多的細(xì)胞碎片，伴有膠質(zhì)細(xì)胞浸潤(rùn)，齒狀回?zé)o明顯的神經(jīng)元缺失。K2組組織學(xué)分級(jí)Ⅱ～Ⅲ級(jí)，CA1、CA3區(qū)ND值為79±13.72和90±14.98，與sham組、K1組相比，組織學(xué)分級(jí)顯著升高(P＜0.05)，ND值顯著降低(P＜0.05)。 第二部分癲癇損傷機(jī)制的探討及依達(dá)拉奉對(duì)海人酸致癇大鼠海馬神經(jīng)元的保護(hù)作用 2.1依達(dá)拉奉對(duì)海人酸致癇

7、大鼠海馬神經(jīng)元保護(hù)作用的組織學(xué)觀察方法: 1.動(dòng)物模型成年健康雄性Wistar大鼠18只，體重260±20g，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分為3組：①假手術(shù)組②KA模型組③依達(dá)拉奉組 2.大鼠海馬CA1、CA3區(qū)及門(mén)區(qū)(CA4)組織形態(tài)學(xué)觀察(方法同第一部分) 結(jié)果: 1.大鼠行為學(xué)表現(xiàn)sham組大鼠無(wú)發(fā)作表現(xiàn)：KA模型組和依達(dá)拉奉注射組發(fā)作級(jí)別及潛伏期無(wú)明顯差別(數(shù)據(jù)略)。 2.大鼠海馬CA1、CA3及門(mén)區(qū)(C

8、A4)組織形態(tài)學(xué)改變結(jié)果顯示：sham組大鼠注射對(duì)側(cè)海馬CA1、CA3及門(mén)區(qū)無(wú)明顯組織損傷(P＞0.05)，組織學(xué)分級(jí)多為0～I(xiàn)級(jí)，CA1、CA3區(qū)ND值分別為198±20.62和212±30.14；KA模型組大鼠CA1、CA3及門(mén)區(qū)可見(jiàn)明顯的組織損傷，組織學(xué)分級(jí)多為Ⅱ～Ⅲ級(jí)，CA1、CA3區(qū)ND值為79±13.72和90±14.98，與sham組相比，組織學(xué)分級(jí)顯著升高(P＜0.05)，ND值顯著降低(P＜0.01)。依達(dá)拉奉組大鼠海

9、馬CA1、CA3及門(mén)區(qū)可見(jiàn)少量、散在性神經(jīng)元壞死，組織學(xué)分級(jí)多I～Ⅱ級(jí)，CA1、CA3區(qū)ND值分別為101±16.85和135±22.17。與模型組相比，組織學(xué)分級(jí)顯著降低(P＜0.05)，ND值顯著升高(P＜0.05)，表明依達(dá)拉奉能夠減輕KA致癇大鼠海馬神經(jīng)元的損傷，對(duì)神經(jīng)元具有保護(hù)作用。 2.2 依達(dá)拉奉抑制海人酸致癇大鼠海馬神經(jīng)元的凋亡過(guò)程方法: 成年健康雄性Wistar大鼠66只，體重260±20g，隨機(jī)分為3

10、組：①假手術(shù)組②KA模型組③依達(dá)拉奉組 結(jié)果: 1.大鼠行為學(xué)表現(xiàn)及海馬組織學(xué)特征：同本部分2.1節(jié)。 2.TUNEL染色結(jié)果sham組大鼠注射對(duì)側(cè)海馬CA1、CA3及門(mén)區(qū)TUNEL染色未見(jiàn)或偶見(jiàn)陽(yáng)性細(xì)胞(P＞0.05)，KA模型組TUNEL染色結(jié)果顯示陽(yáng)性細(xì)胞從術(shù)后1d開(kāi)始增多，3d達(dá)高峰，7d回落，14d后陽(yáng)性細(xì)胞消失，模型組大鼠癲癇發(fā)作后1～7天內(nèi)TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)與sham組相比明顯增多，有顯著性差異(

11、P＜0.05)：依達(dá)拉奉組在這一時(shí)間內(nèi)TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)明顯少于模型組(P＜0.05)，但仍高于sham組(P＜0.05)。以上結(jié)果提示：癲癇發(fā)作時(shí)可引起以凋亡為主的神經(jīng)元損傷，依達(dá)拉奉能夠部分抑制癲癇發(fā)作后的神經(jīng)元凋亡。 2.3 依達(dá)拉奉抑制海人酸致癇大鼠海馬神經(jīng)元脂質(zhì)過(guò)氧化過(guò)程方法: 成年健康雄性Wistar大鼠66只，體重260±20g，隨機(jī)分為3組：①假手術(shù)組(sham)(n=6)：方法同本部分2.1；②模型組

12、(n=30)：方法同本部分2.1；③依達(dá)拉奉組(n=30)：方法同本部分2.1，模型組和依達(dá)拉奉組分別設(shè)5min、6h、24h、72h、7d 5個(gè)時(shí)間點(diǎn)，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)6只大鼠，于預(yù)訂的時(shí)間點(diǎn)斷頭取腦，分離左側(cè)海馬，檢測(cè)左側(cè)海馬組織中SOD活性和MDA含量。 結(jié)果: 1.大鼠行為學(xué)表現(xiàn)及海馬組織學(xué)特征：同本部分2.1節(jié)。 2.大鼠注藥對(duì)側(cè)海馬SOD活性和MDA含量的測(cè)定結(jié)果結(jié)果顯示：sham組各個(gè)時(shí)間點(diǎn)SOD活性及M

13、DA含量均無(wú)明顯變化(P＞0.05)；模型組于KA注射后6h可見(jiàn)SOD活性下降，MDA含量升高，于3d時(shí)SOD活性降至最低(P＜0.01)，MDA含量升至最高(P＜0.01)，隨后SOD活性開(kāi)始回升，MDA生成量開(kāi)始下降，于7d時(shí)SOD活性恢復(fù)至基線水平；依達(dá)拉奉組于6h～72h時(shí)間段內(nèi)SOD活性明顯高于模型組(P＜0.05)，MDA含量明顯低于模型組(P＜0.05)?！阋陨辖Y(jié)果提示，依達(dá)拉奉可有效的提高SOD活性并降低MDA生成，從而

14、提高機(jī)體的抗氧化能力，起到保護(hù)神經(jīng)元的作用。 2.4 依達(dá)拉奉對(duì)海人酸致癇大鼠認(rèn)知功能的影響方法: 成年健康雄性Wistat大鼠30只，體重260±20g，隨機(jī)分為3組：①假手術(shù)組(sham)(n=6)：方法同本部分2.1：②模型組(n=12)：方法同本部分2.1;③依達(dá)拉奉(n=12)：方法同本部分2.1。以上三組大鼠分別于術(shù)后24h和8w行Morris水迷宮試驗(yàn)，進(jìn)行認(rèn)知功能和運(yùn)動(dòng)能力的檢測(cè)。 結(jié)果:

15、 1.定位航行試驗(yàn)(Place navigation test，PNT)逃避潛伏期各實(shí)驗(yàn)組大鼠于24h開(kāi)始的PNT中，各時(shí)段逃避潛伏期無(wú)顯著性差異(P＞0.05)，模型組、依達(dá)拉奉組在8w時(shí)開(kāi)始的PNT中，與sham組相比大鼠各個(gè)時(shí)段的逃避潛伏期均明顯延長(zhǎng)，有顯著性差異(P＜0.05)；依達(dá)拉奉組與模型組相比，大鼠逃避潛伏期明顯縮短，且有顯著性差異(P＜0.05)。 2.空間探索試驗(yàn)(Spatial probe test，SPT

16、)：在原平臺(tái)象限中游泳時(shí)間的百分比和穿環(huán)數(shù)各組大鼠在原有平臺(tái)象限內(nèi)游泳的時(shí)間明顯高于其他緣限；模型組和依達(dá)拉奉組在造模成功后24h開(kāi)始的STP中，與sham組相比原平臺(tái)象限內(nèi)的游泳時(shí)間、穿環(huán)數(shù)均無(wú)顯著性差異(P＞0.05)。隨著發(fā)作時(shí)間的延長(zhǎng)，模型組和依達(dá)拉奉組大鼠于造模成功后8w開(kāi)始的STP，與sham組相比原平臺(tái)象限內(nèi)的游泳時(shí)間明顯縮短，穿環(huán)數(shù)明顯減少，有顯著性差異(P＜0.05)。依達(dá)拉奉組與模型組相比，大鼠在原平臺(tái)象限內(nèi)的游泳時(shí)

17、間明顯延長(zhǎng)，穿環(huán)數(shù)明顯增多，有顯著性差異(P＜0.05)。 以上結(jié)果提示：長(zhǎng)期、反復(fù)的慢性癇性發(fā)作可引起認(rèn)知功能減退、學(xué)習(xí)記憶能力下降等表現(xiàn)，依達(dá)拉奉可部分改善由于癲癇發(fā)作引起的認(rèn)知功能障礙。 結(jié)論: 1.在KA大鼠致癇模型中，觀察癲癇發(fā)作本身所致的神經(jīng)元損傷以及干預(yù)后的變化情況，較為理想的參數(shù)為4μg/kg(0.4μg/μ1)KA一側(cè)海馬CA3區(qū)注射，將對(duì)側(cè)海馬作為研究對(duì)象。 2.在KA大鼠致癇模型中，