癲癇損傷機制的探討及依達拉奉對海人酸致癇大鼠海馬神經(jīng)元的保護作用.pdf

1、癲癇(epilepsy)是一組由已知或未知病因所引起，腦部神經(jīng)元高度同步化，且常具自限性的異常放電所導致，以反復發(fā)作性、短暫性、通常為刻板性的中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能失常為特征的綜合征。目前癲癇的治療主要靠藥物控制癇性發(fā)作，抑制致癇區(qū)神經(jīng)元的異常放電，從而減輕神經(jīng)元的繼發(fā)性損傷。依達拉奉(edaravone)是一種新型自由基清除劑，它能夠清除腦梗塞周圍缺血半暗帶羥自由基、抑制脂質(zhì)過氧化，從而抑制腦細胞的損傷和凋亡，對腦血管病缺血缺氧導致的神經(jīng)元

2、損傷具有明顯的保護作用。 第一部分海人酸癲癇模型的制作方法： 1.動物模型 成年健康雄性Wistar大鼠18只，體重260±20g，實驗動物隨機分為2大組：(1)假手術(shù)組(2)模型組 2.腦電圖 大鼠麻醉后固定于立體定向儀上，放置深部電極，待大鼠清醒后，按上述分組制作模型，描記腦電圖。 3.大鼠行為學觀察大 鼠海馬腹后部CA3區(qū)注射KA后，觀察癲癇發(fā)作情況，并依據(jù)Racine六級癲癇發(fā)作

3、評價標準，對KA致癇大鼠發(fā)作進行分級，按實驗要求將大鼠分入K1和K2組。 4 大鼠海馬CA1、CA3區(qū)及門區(qū)(CA4)組織形態(tài)學觀察大鼠于注藥或假手術(shù)后7天斷頭取腦，石蠟切片進行硫堇染色，光學顯微鏡下觀察注藥對側(cè)(左側(cè))海馬CA1、CA3區(qū)及門區(qū)組織形態(tài)，并對其組織學改變進行分級(0級：無神經(jīng)元死亡；Ⅰ級：散在神經(jīng)元死亡；Ⅱ級：成片的神經(jīng)元死亡；Ⅲ級：幾乎全部的神經(jīng)元死亡)，取左側(cè)等級作為統(tǒng)計值。高倍鏡下計數(shù)海馬CA1、CA3區(qū)

4、每1mm區(qū)段內(nèi)細胞膜完整、胞核飽滿、核仁清晰的錐體細胞數(shù)目，每張切片取左側(cè)海馬計數(shù)3個區(qū)段平均數(shù)為神經(jīng)元密度(Neuronaldensity，ND)。本實驗取注射對側(cè)海馬作為研究對象。 結(jié)果: 1.大鼠行為學表現(xiàn)sham組大鼠行為無異常。 2.腦電圖 大鼠發(fā)作期腦電圖顯示明顯放電，為棘波、尖波、棘-慢綜合波、尖-慢綜合波，sham組大鼠腦電圖無明顯異常。 3.大鼠海馬CA1、CA3及門區(qū)(CA4)組

5、織形態(tài)學改變結(jié)果顯示，硫堇染色后sham組和K1組(小劑量海人酸注射組)對側(cè)海馬無明顯損傷，組織學分級多為0～Ⅰ級，海馬CA1、CA3區(qū)及門區(qū)細胞無缺失，排列整體，形態(tài)完整，胞核飽滿，核仁清晰，尼氏體豐富，細胞有突起。ND值sham組CA1和CA3分別為198±20.62和212±30.14；K1組CA1和CA3分別為186±19.45和208±27.73。K2組大鼠海馬神經(jīng)元可見明顯損傷，表現(xiàn)為CA1、CA3及門區(qū)細胞缺失、排列紊亂，

6、胞質(zhì)濃縮、深染，細胞形態(tài)有典型的多角形變?yōu)槿切位虿灰?guī)則型，殘存的錐體細胞周圍可見較多的細胞碎片，伴有膠質(zhì)細胞浸潤，齒狀回無明顯的神經(jīng)元缺失。K2組組織學分級Ⅱ～Ⅲ級，CA1、CA3區(qū)ND值為79±13.72和90±14.98，與sham組、K1組相比，組織學分級顯著升高(P＜0.05)，ND值顯著降低(P＜0.05)。 第二部分癲癇損傷機制的探討及依達拉奉對海人酸致癇大鼠海馬神經(jīng)元的保護作用 2.1依達拉奉對海人酸致癇

7、大鼠海馬神經(jīng)元保護作用的組織學觀察方法: 1.動物模型成年健康雄性Wistar大鼠18只，體重260±20g，實驗動物隨機分為3組：①假手術(shù)組②KA模型組③依達拉奉組 2.大鼠海馬CA1、CA3區(qū)及門區(qū)(CA4)組織形態(tài)學觀察(方法同第一部分) 結(jié)果: 1.大鼠行為學表現(xiàn)sham組大鼠無發(fā)作表現(xiàn)：KA模型組和依達拉奉注射組發(fā)作級別及潛伏期無明顯差別(數(shù)據(jù)略)。 2.大鼠海馬CA1、CA3及門區(qū)(C

8、A4)組織形態(tài)學改變結(jié)果顯示：sham組大鼠注射對側(cè)海馬CA1、CA3及門區(qū)無明顯組織損傷(P＞0.05)，組織學分級多為0～I級，CA1、CA3區(qū)ND值分別為198±20.62和212±30.14；KA模型組大鼠CA1、CA3及門區(qū)可見明顯的組織損傷，組織學分級多為Ⅱ～Ⅲ級，CA1、CA3區(qū)ND值為79±13.72和90±14.98，與sham組相比，組織學分級顯著升高(P＜0.05)，ND值顯著降低(P＜0.01)。依達拉奉組大鼠海

9、馬CA1、CA3及門區(qū)可見少量、散在性神經(jīng)元壞死，組織學分級多I～Ⅱ級，CA1、CA3區(qū)ND值分別為101±16.85和135±22.17。與模型組相比，組織學分級顯著降低(P＜0.05)，ND值顯著升高(P＜0.05)，表明依達拉奉能夠減輕KA致癇大鼠海馬神經(jīng)元的損傷，對神經(jīng)元具有保護作用。 2.2 依達拉奉抑制海人酸致癇大鼠海馬神經(jīng)元的凋亡過程方法: 成年健康雄性Wistar大鼠66只，體重260±20g，隨機分為3

10、組：①假手術(shù)組②KA模型組③依達拉奉組 結(jié)果: 1.大鼠行為學表現(xiàn)及海馬組織學特征：同本部分2.1節(jié)。 2.TUNEL染色結(jié)果sham組大鼠注射對側(cè)海馬CA1、CA3及門區(qū)TUNEL染色未見或偶見陽性細胞(P＞0.05)，KA模型組TUNEL染色結(jié)果顯示陽性細胞從術(shù)后1d開始增多，3d達高峰，7d回落，14d后陽性細胞消失，模型組大鼠癲癇發(fā)作后1～7天內(nèi)TUNEL陽性細胞數(shù)與sham組相比明顯增多，有顯著性差異(

11、P＜0.05)：依達拉奉組在這一時間內(nèi)TUNEL陽性細胞數(shù)明顯少于模型組(P＜0.05)，但仍高于sham組(P＜0.05)。以上結(jié)果提示：癲癇發(fā)作時可引起以凋亡為主的神經(jīng)元損傷，依達拉奉能夠部分抑制癲癇發(fā)作后的神經(jīng)元凋亡。 2.3 依達拉奉抑制海人酸致癇大鼠海馬神經(jīng)元脂質(zhì)過氧化過程方法: 成年健康雄性Wistar大鼠66只，體重260±20g，隨機分為3組：①假手術(shù)組(sham)(n=6)：方法同本部分2.1；②模型組

12、(n=30)：方法同本部分2.1；③依達拉奉組(n=30)：方法同本部分2.1，模型組和依達拉奉組分別設5min、6h、24h、72h、7d 5個時間點，每個時間點6只大鼠，于預訂的時間點斷頭取腦，分離左側(cè)海馬，檢測左側(cè)海馬組織中SOD活性和MDA含量。 結(jié)果: 1.大鼠行為學表現(xiàn)及海馬組織學特征：同本部分2.1節(jié)。 2.大鼠注藥對側(cè)海馬SOD活性和MDA含量的測定結(jié)果結(jié)果顯示：sham組各個時間點SOD活性及M

13、DA含量均無明顯變化(P＞0.05)；模型組于KA注射后6h可見SOD活性下降，MDA含量升高，于3d時SOD活性降至最低(P＜0.01)，MDA含量升至最高(P＜0.01)，隨后SOD活性開始回升，MDA生成量開始下降，于7d時SOD活性恢復至基線水平；依達拉奉組于6h～72h時間段內(nèi)SOD活性明顯高于模型組(P＜0.05)，MDA含量明顯低于模型組(P＜0.05)?！阋陨辖Y(jié)果提示，依達拉奉可有效的提高SOD活性并降低MDA生成，從而

14、提高機體的抗氧化能力，起到保護神經(jīng)元的作用。 2.4 依達拉奉對海人酸致癇大鼠認知功能的影響方法: 成年健康雄性Wistat大鼠30只，體重260±20g，隨機分為3組：①假手術(shù)組(sham)(n=6)：方法同本部分2.1：②模型組(n=12)：方法同本部分2.1;③依達拉奉(n=12)：方法同本部分2.1。以上三組大鼠分別于術(shù)后24h和8w行Morris水迷宮試驗，進行認知功能和運動能力的檢測。 結(jié)果:

15、 1.定位航行試驗(Place navigation test，PNT)逃避潛伏期各實驗組大鼠于24h開始的PNT中，各時段逃避潛伏期無顯著性差異(P＞0.05)，模型組、依達拉奉組在8w時開始的PNT中，與sham組相比大鼠各個時段的逃避潛伏期均明顯延長，有顯著性差異(P＜0.05)；依達拉奉組與模型組相比，大鼠逃避潛伏期明顯縮短，且有顯著性差異(P＜0.05)。 2.空間探索試驗(Spatial probe test，SPT

16、)：在原平臺象限中游泳時間的百分比和穿環(huán)數(shù)各組大鼠在原有平臺象限內(nèi)游泳的時間明顯高于其他緣限；模型組和依達拉奉組在造模成功后24h開始的STP中，與sham組相比原平臺象限內(nèi)的游泳時間、穿環(huán)數(shù)均無顯著性差異(P＞0.05)。隨著發(fā)作時間的延長，模型組和依達拉奉組大鼠于造模成功后8w開始的STP，與sham組相比原平臺象限內(nèi)的游泳時間明顯縮短，穿環(huán)數(shù)明顯減少，有顯著性差異(P＜0.05)。依達拉奉組與模型組相比，大鼠在原平臺象限內(nèi)的游泳時

17、間明顯延長，穿環(huán)數(shù)明顯增多，有顯著性差異(P＜0.05)。 以上結(jié)果提示：長期、反復的慢性癇性發(fā)作可引起認知功能減退、學習記憶能力下降等表現(xiàn)，依達拉奉可部分改善由于癲癇發(fā)作引起的認知功能障礙。 結(jié)論: 1.在KA大鼠致癇模型中，觀察癲癇發(fā)作本身所致的神經(jīng)元損傷以及干預后的變化情況，較為理想的參數(shù)為4μg/kg(0.4μg/μ1)KA一側(cè)海馬CA3區(qū)注射，將對側(cè)海馬作為研究對象。 2.在KA大鼠致癇模型中，