香芹酚對匹魯卡品致癇大鼠海馬神經(jīng)元保護(hù)作用及其機(jī)制研究.pdf

1、背景及目的:
　　癲癇（epilepsy，EP）是一種常見的疾病，我國目前有900萬以上癲癇患者，每年新發(fā)癲癇患者65—70萬。反復(fù)的癲癇發(fā)作對患者、家庭及社會帶來了危害。但癲癇的發(fā)病機(jī)制尚不明確，因此研究其發(fā)病機(jī)理及尋求新的治療靶點(diǎn)尤其重要。
　　內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（endoplasmic reticulum，ER)是一種重要的細(xì)胞器，它參與細(xì)胞內(nèi)鈣離子的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)、蛋白質(zhì)的正確折疊及運(yùn)輸。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)可被高血糖、高血壓、氧化應(yīng)激、

2、炎癥等應(yīng)激狀態(tài)激活。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress，ERS)是一種新的凋亡信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，其可能成為癲癇治療的新的靶點(diǎn)。
　　一定條件的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激時，錯誤及未折疊蛋白大量積聚， GRP78( glucose-regulated protein-78)表達(dá)增加，且GRP78與跨膜蛋白分離，未折疊蛋白反應(yīng)（unfolded protein response，UPR）激活，它可減少錯誤的蛋白質(zhì)在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)

3、的聚集來減輕組織損傷，提高內(nèi)質(zhì)網(wǎng)對蛋白質(zhì)的折疊效能。但過度的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激則會激活相關(guān)凋亡信號通路，引發(fā)細(xì)胞凋亡。CHOP(C/EBP homologous protin)是一種凋亡相關(guān)蛋白，ERS時，其表達(dá)迅速增加，介導(dǎo)了凋亡信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。Caspase12位于 ER的胞質(zhì)面，以前體形式存在，無活性，它通過激活下游的Caspase-9， Caspase-3，介導(dǎo)細(xì)胞凋亡。
　　香芹酚（Carvacrol，CAR），由各種植物中提取，作為

4、一種食品添加劑及香料被廣泛應(yīng)用。國外研究發(fā)現(xiàn)CAR具有較強(qiáng)的抗腫瘤、抗氧化、抗凋亡、抗抑郁等特性，但香芹酚對癲癇大鼠海馬的作用目前國內(nèi)外尚無相關(guān)報道。本研究用氯化鋰-匹魯卡品誘導(dǎo)SD大鼠癲癇大鼠持續(xù)狀態(tài)( status epilepticus，SE)模型，采用 Nissl及 TUNEL染色法檢測海馬組織損傷及細(xì)胞凋亡，并用香芹酚30mg/kg及60mg/kg預(yù)處理，觀察香芹酚對匹魯卡品（pilocarpine， PILO）致癇大鼠海馬神

5、經(jīng)元損傷和凋亡的影響，并觀察不同劑量香芹酚對癲癇發(fā)作后內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)分子GRP78、caspase-12、CHOP表達(dá)水平變化的影響。
　　材料與方法:
　　140只健康雄性SD大鼠，6-8周，200-250g，隨機(jī)分為CON組、PILO組、PILO+CAR30(30mg/kg)組和PILO+CAR60(60mg/kg)組四組，PILO組包括2h組、8h組、24h組、72h亞組，每組均20只。所有的實(shí)驗動物均先腹腔注射氯化鋰

6、(127mg/kg)，16-20h后腹腔注射匹魯卡品(30mg/kg)，氫溴酸東莨菪堿(1mg／kg)在注射匹魯卡品前30min皮下注射，它的作用主要為拮抗匹魯卡品的外周膽堿能反應(yīng)。PILO+CAR30組和PILO+CAR60組大鼠分別在注射匹魯卡品前30min腹腔注射香芹酚30mg/kg、60mg/kg。對照(CON)組腹腔注射與匹魯卡品等體積的生理鹽水。采用 Racine癇性發(fā)作分級標(biāo)準(zhǔn)作為癲癇發(fā)作分級判定標(biāo)準(zhǔn)，認(rèn)為達(dá)Ⅳ或 V級癲癇

7、模型制作成功。達(dá)到癲癇持續(xù)狀態(tài)后需持續(xù)60min，腹腔注射地西泮(10mg/kg)終止發(fā)作。模型制造成功后各組及PILO組24h亞組一半大鼠在SE后24h麻醉后灌注取腦，采用Nissl和TUNEL法檢測海馬組織損傷和神經(jīng)元凋亡情況，各組剩余一半大鼠在SE后24h麻醉后處死，PILO組各亞組剩余大鼠按各時間點(diǎn)斷頭，低溫條件下取出雙側(cè)海馬，采用Western blot法檢測GRP78、caspase12、CHOP表達(dá)變化。
　　結(jié)果:

8、
　　1．大鼠行為學(xué)觀察：CON組大鼠無癇性發(fā)作，PILO各組、PILO+CAR30組和PILO+CAR60三組大鼠出現(xiàn)癇性發(fā)作，各組及亞組大鼠造模成功率差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。
　　2．Nissl染色結(jié)果：與CON組相比，PILO組、PILO+CAR30、PILO+CAR60三組大鼠 SE后海馬組織明顯損傷，海馬神經(jīng)元數(shù)目較對照組均顯著減少（P<0.05）；與PILO組相比，PILO+CAR組海馬神經(jīng)元顯著增多（

9、P<0.05）；與PILO+CAR30組比較，PILO+CAR60組可見海馬神經(jīng)元顯著增多（P<0.05）。
　　3．TUNEL染色結(jié)果：與CON組相比，PILO組、PILO+CAR30、PILO+CAR60三組海馬神經(jīng)元凋亡細(xì)胞數(shù)目增多(P<0.05)；與PILO組相比，PILO+CAR組神經(jīng)元凋亡數(shù)目減少(P<0.05)；與 PILO+CAR30組比較，PILO+CAR60組可見神經(jīng)元凋亡數(shù)目顯著減少（P<0.05）。

10、　　4．Western blot結(jié)果：與CON組比較，PILO組GRP78于SE后2h升高，8h達(dá)到最高，24h開始下降；caspase12及CHOP癲癇后2h升高，24h達(dá)最高，保持到72h。與PILO組比較，PIL0+CAR組GRP78升高，caspase12、CHOP表達(dá)降低；與PILO+CAR30組比較，PILO+CAR60組GRP78升高，caspase12與CHOP表達(dá)降低。
　　結(jié)論:
　　1.癲癇發(fā)作后GRP