面向現(xiàn)場檢測核酸擴(kuò)增系統(tǒng)研究.pdf

1、目的：PCR技術(shù)是20世紀(jì)末分子生物學(xué)領(lǐng)域的重大成果，因特異性強、靈敏度高以及對樣本純度要求低等優(yōu)點，PCR技術(shù)被廣泛運用于遺傳病研究、腫瘤發(fā)病機(jī)理探討、生命科學(xué)研究等領(lǐng)域。21世紀(jì)初，在新發(fā)突發(fā)傳染病檢測和應(yīng)對、災(zāi)后食物和飲用水的安全檢測、生物反恐等領(lǐng)域，采用 PCR對未知樣本檢測的技術(shù)更是在現(xiàn)場得到了廣泛的應(yīng)用。與 PCR技術(shù)應(yīng)用相輔相成的是核酸擴(kuò)增系統(tǒng)的研究和發(fā)展，作為完成樣本擴(kuò)增的主要部分，核酸擴(kuò)增系統(tǒng)工作參數(shù)直接影響著擴(kuò)增速度

2、、擴(kuò)增效率以及擴(kuò)增結(jié)果準(zhǔn)確性。傳統(tǒng)核酸擴(kuò)增系統(tǒng)面向的往往是實驗室生命科學(xué)研究，主要特點是穩(wěn)定性好、反應(yīng)通量大，但是在諸如食品飲用水安全檢測、生物反恐等領(lǐng)域的現(xiàn)場應(yīng)用中，傳統(tǒng)的核酸擴(kuò)增系統(tǒng)在系統(tǒng)便攜化程度、擴(kuò)增速度以及結(jié)果準(zhǔn)確性方面存在不足。此外，現(xiàn)場應(yīng)用中為了對未知樣品進(jìn)行快速檢測，使用者往往需要對擴(kuò)增程序進(jìn)行篩選，傳統(tǒng)核酸擴(kuò)增系統(tǒng)根本沒用相應(yīng)的設(shè)計和功能。為了推動 PCR技術(shù)在現(xiàn)場快速檢測的應(yīng)用，有必要對現(xiàn)有核酸擴(kuò)增系統(tǒng)進(jìn)行研究和改進(jìn)

3、，實現(xiàn)儀器的便攜化、擴(kuò)增的快速化和準(zhǔn)確化并支持?jǐn)U增程序篩選。
　　方法和內(nèi)容：針對傳統(tǒng)核酸擴(kuò)增系統(tǒng)在現(xiàn)場快速檢測應(yīng)用中所面臨的問題，本文從核酸擴(kuò)增系統(tǒng)工作原理入手，研究用于快速檢測，支持?jǐn)U增篩選的快速化、準(zhǔn)確化和便攜化核酸擴(kuò)增系統(tǒng)。主要研究內(nèi)容包括以下幾個方面：
　　1.以擴(kuò)增系統(tǒng)升降溫速度作為首要指標(biāo)，對不同核酸擴(kuò)增系統(tǒng)熱源和換熱方式進(jìn)行熱力學(xué)分析，依據(jù)換熱過程傳熱系數(shù)和系統(tǒng)實際升降溫參數(shù)選擇合理換熱方式和系統(tǒng)熱源；

4、>　　2.以便攜化為目標(biāo)進(jìn)行反應(yīng)腔結(jié)構(gòu)設(shè)計，設(shè)計過程中考慮結(jié)構(gòu)的可集成化程度，保證其內(nèi)部結(jié)構(gòu)有利于熱源熱量的傳遞，換熱過程有足夠的換熱強度；
　　3.選擇系統(tǒng)的熱量傳遞模塊，利用ANSYS軟件對反應(yīng)腔內(nèi)部溫度均一性進(jìn)行仿真，并對實際的核酸擴(kuò)增系統(tǒng)不同區(qū)域進(jìn)行溫度實驗，記錄各處的溫度值，結(jié)合仿真結(jié)果和實驗結(jié)果評價系統(tǒng)內(nèi)部溫度均一性、升降溫速度、精確度是否滿足設(shè)計要求；
　　4.針對核酸擴(kuò)增系統(tǒng)普遍存在的樣本熱源溫度延遲問題，分

5、析核酸擴(kuò)增系統(tǒng)熱源熱量傳遞至樣本的理論時間常數(shù)。以本文設(shè)計的核酸擴(kuò)增系統(tǒng)為平臺，計算其獨立反應(yīng)腔的樣本與熱源溫度理論延遲，通過具體溫度實驗，測量并計算反應(yīng)腔的實際溫度延遲。根據(jù)理論延遲分析和實際延遲計算，選擇合理的溫控時間，從熱源熱量傳遞至樣本過程的換熱機(jī)理上對系統(tǒng)溫度延遲進(jìn)行優(yōu)化，提高整體擴(kuò)增速度；
　　5.采用本文設(shè)計的面向現(xiàn)場檢測核酸擴(kuò)增系統(tǒng)進(jìn)行擴(kuò)增實驗，擴(kuò)增結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn) PCR擴(kuò)增結(jié)果通過電泳進(jìn)行比對，依據(jù)比對結(jié)果評價本文核

6、酸擴(kuò)增系統(tǒng)擴(kuò)增效果。
　　結(jié)果：
　　1.通過對比氣浴式和變溫金屬塊式核酸擴(kuò)增系統(tǒng)熱量傳遞模塊的傳熱系數(shù)，得知氣浴式核酸擴(kuò)增系統(tǒng)的熱量傳遞過程較變溫金屬塊式更為簡單，氣浴式系統(tǒng)的傳熱系數(shù)大于變溫金屬塊式。結(jié)合實際PCR儀工作參數(shù)，選擇氣浴式作為本文核酸擴(kuò)增系統(tǒng)換熱方式；
　　2.在以氣浴式為換熱方式的基礎(chǔ)上，計算以電熱絲和紅外線燈作為熱源的系統(tǒng)內(nèi)部熱源與空氣的換熱強度，綜合考慮不同熱源下實際產(chǎn)品的升降溫速度以及其體積參

7、數(shù)，選擇電熱絲作為本文核酸擴(kuò)增系統(tǒng)熱源；
　　3.提出利用多個獨立微型反應(yīng)腔進(jìn)行獨立擴(kuò)增的設(shè)計方案以實現(xiàn)擴(kuò)增程序篩選，在保證反應(yīng)腔內(nèi)部空氣與反應(yīng)管對流換熱強度的基礎(chǔ)上，對微型反應(yīng)腔結(jié)構(gòu)進(jìn)行設(shè)計，最終選擇高寬比為2:1的矩形截面通道作為反應(yīng)腔，規(guī)格參數(shù)為80mm×40mm×20mm（長×高×寬）；
　　4.放棄了傳統(tǒng)氣浴式核酸擴(kuò)增系統(tǒng)占用體積較大的攪拌風(fēng)機(jī)設(shè)計，選用與矩形截面面積相同的90％孔隙率3mm厚的泡沫銅作為傳熱模塊，

8、均勻通道內(nèi)部空氣溫度。經(jīng)過CFD仿真和實驗驗證，得知通道內(nèi)部空氣均一性在±0.52℃，最大升溫速度為10℃/s，最大降溫速度為12℃/s，溫度精確度為±0.55℃，滿足設(shè)計需求；
　　5.針對核酸擴(kuò)增普遍存在的樣本與熱源溫度延遲問題，對核酸擴(kuò)增系統(tǒng)進(jìn)行熱力學(xué)分析，根據(jù)非穩(wěn)態(tài)導(dǎo)熱過程時間常數(shù)計算，計算熱量從熱源傳遞至樣本各階段的理論時間常數(shù)，依據(jù)分析和計算結(jié)果對樣本與熱源溫度延遲進(jìn)行優(yōu)化。優(yōu)化后的微型反應(yīng)腔內(nèi)部樣本溫度從變性降溫至退

9、火的時間約為19.4s，從退火升溫至延伸階段的時間約為8.1s，從延伸升溫至變性階段的時間約為6.4s，整個擴(kuò)增過程較優(yōu)化前的樣本升降溫速度有了明顯改善；
　　6.采用微型反應(yīng)腔和標(biāo)準(zhǔn)PCR儀擴(kuò)增枯草芽孢桿菌和單增李斯特菌，對比產(chǎn)物電泳圖，可知微型反應(yīng)腔擴(kuò)增效果良好，滿足設(shè)計需求；采用優(yōu)化前后的微型反應(yīng)腔對單增李斯特菌進(jìn)行擴(kuò)增，對比優(yōu)化前后擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳圖，可知經(jīng)改變溫差優(yōu)化樣本與空氣溫度延遲后，微型反應(yīng)腔擴(kuò)增效果有了一定提升。<