利用滾環(huán)擴增和納米粒子均相無標記檢測核酸的研究.pdf

1、核酸及其單核苷酸多態(tài)性（SNP）的分析檢測在當前生化研究和臨床診斷等領域具有重要的意義。開發(fā)簡便、快速、高靈敏和特異性好的均相無標記的核酸和SNP的檢測新方法具有廣泛的應用前景。論文主要應用滾環(huán)擴增（RCA）和納米粒子探針技術，結合生物發(fā)光、分子熒光和共振光散射等檢測技術研究開發(fā)了系列均相無標記檢測核酸和SNP的新方法，主要內容如下：
　　 1、結合簡便、高效的滾環(huán)擴增反應和高靈敏的熒光蟲素生物發(fā)光反應，建立了均相無標記檢測SN

2、P的新方法。方法基于突變型DNA可特異的引發(fā)滾環(huán)擴增反應，應用螢火蟲素生物發(fā)光反應檢測滾環(huán)擴增反應中產生的大量焦磷酸根。相對照，野生型DNA不能引發(fā)RCA反應，根據(jù)二者生物發(fā)光信號的顯著差異，可實現(xiàn)突變型DNA的高靈敏度檢測和特異地區(qū)分單堿基差別，方法對突變型DNA的定量檢出限為0.45 pmol/L，可精確測定1％突變頻率。
　　 2、基于滾環(huán)擴增反應的原理，在滾環(huán)擴增反應過程中，加入與滾環(huán)擴增產物互補的反向引物，該引物以滾環(huán)

3、擴增產物為模板引發(fā)反向頂替支化擴增，產生大量的單鏈和雙鏈的DNA產物，利用特異性的DNA檢測熒光染料SYBR Green I進行熒光檢測，建立了滾環(huán)擴增均相無標記熒光法檢測SNP的新方法。根據(jù)突變型和野生型DNA產生的熒光信號差異，實現(xiàn)了1％突變頻率的特異性檢測和高靈敏的定量檢測突變型DNA，檢出限為8.6 fmol/L。
　　 3、應用滾環(huán)擴增反應均相無標記檢測微小RNA（miRNA）。方法以miRNA為模板使掛鎖探針特異性的

4、連接成環(huán)；然后以環(huán)形DNA探針為模板，miRNA直接作為引物引發(fā)滾環(huán)擴增反應，同時加入與RCA反應產物互補的反向引物，引發(fā)支化擴增，結果產生大量多種長度的單鏈和雙鏈的DNA產物，應用特異性的DNA檢測熒光染料進行定量。方法無需反轉錄步驟，操作簡便、靈敏度高、可特異性地檢測單堿基差別的miRNAs。
　　 4、制備了穩(wěn)定性好、便宜和生物兼容性好的氫氧化鐵納米粒子，通過靜電力作用，鐵納米粒子以DNA分子為模板進行組裝聚集，應用高靈敏