基于滾環(huán)擴(kuò)增的目視法核酸檢測技術(shù).pdf

1、核酸診斷在疾病診斷和治療中具有重要意義，現(xiàn)有的分子生物學(xué)檢測技術(shù)通常需要精密儀器和專業(yè)人員操作，但是在一些邊遠(yuǎn)地區(qū)或貧困地區(qū)，往往缺乏資金和設(shè)備，因此亟待開發(fā)出低廉簡便的核酸檢測產(chǎn)品。本論文中，我們建立了基于滾環(huán)擴(kuò)增(RCA)和磁珠聚集顯色的目視法核酸檢測方法(RCA-MPA)。首先設(shè)計(jì)了具有高度靶向特異性的鎖式探針，通過對(duì)基因組DNA進(jìn)行酶切處理得到單鏈靶向分子，然后進(jìn)行靶向識(shí)別和探針連接，最后進(jìn)行RCA反應(yīng)和磁珠聚集顯色。磁珠與長鏈

2、DNA之間通過物理性吸附作用相互纏繞，被磁鐵聚集成不易分散的團(tuán)聚物，短鏈DNA(＜1 kb)則無此功能，因此基于此原理可以對(duì)溶液中的擴(kuò)增產(chǎn)物實(shí)現(xiàn)肉眼檢測。本論文以生殖器人乳頭瘤病毒-18(HPV-18)E7基因上的一段序列，作為模型樣品，進(jìn)行RCA-MPA的可行性實(shí)驗(yàn)。成功實(shí)現(xiàn)靶向特異性測定，檢測限為0.62 amol(124 fM)。此外，還在HeLa細(xì)胞內(nèi)以及添加了靶向分子的血液樣品中測到了HPV-18 E7基因，初步證明該方法可以

3、用于實(shí)際樣品分析。RCA-MPA法具有高特異性、高靈敏度和低成本等特點(diǎn)，有望用于現(xiàn)場診斷。
　　 第一章緒論部分介紹了以聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)、環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(LAMP)和RCA為代表的核酸擴(kuò)增技術(shù)的原理、方法和應(yīng)用，并重點(diǎn)綜述了RCA技術(shù)的發(fā)展、種類、特點(diǎn)以及檢測方法和應(yīng)用。最后介紹了幾種適用于現(xiàn)場檢測的技術(shù)，如芯片實(shí)驗(yàn)室、試紙條生物傳感器和基于納米粒子的比色法核酸檢測技術(shù)等。
　　 第二章是L-RCA核酸檢測方

4、法的構(gòu)建。建立了一套以DNA為靶向分子的均相基于連接滾環(huán)擴(kuò)增(L-RCA)擴(kuò)增體系，通過凝膠電泳考察連接反應(yīng)和RCA反應(yīng)的效果，使用外切酶酶切處理的方法，驗(yàn)證連接產(chǎn)物中是否存在環(huán)狀DNA分子，并且改進(jìn)連接條件，提高了padlock成環(huán)的概率。此外，對(duì)比了單引物RCA和雙引物RCA的擴(kuò)增效率和背景干擾程度。最終證實(shí)單引物RCA具有更強(qiáng)的區(qū)分信號(hào)和背景的能力，在現(xiàn)場檢測方面擁有巨大的潛能。
　　 第三章為HPV-18基因檢測。在本工

5、作中，建立了一套基于L-RCA反應(yīng)和磁珠聚集顯色的目視法核酸檢測體系。連接反應(yīng)中以Taq DNA連接酶替代T4DNA連接酶，減少非特異性連接產(chǎn)生的背景信號(hào)，提高檢測特異性。以磁珠聚集顯色方法替代常規(guī)的熒光標(biāo)記方法，實(shí)現(xiàn)目視法檢測HPV-18病毒E7基因，最低檢測限為0.62 amol，與常規(guī)的肉眼檢測方法相比，靈敏度提高了1000倍。該方法被成功用于體外培養(yǎng)的細(xì)胞系（HeLa和Huh-7）和添加了靶向分子的血液樣品中HPV-18基因的檢

6、測，證明具有檢測實(shí)際樣品的能力。
　　 綜上所述，通過本論文的研究工作，我們提出了一種基于滾環(huán)擴(kuò)增和磁珠聚集顯色的核酸檢測技術(shù)。不同于以往基于微型化系統(tǒng)的芯片技術(shù)，RCA-MPA方法通過等溫?cái)U(kuò)增和聚集顯色來實(shí)現(xiàn)核酸檢測，不需要傳統(tǒng)的循環(huán)控溫系統(tǒng)和熒光檢測設(shè)備，從方法學(xué)方面簡化了系統(tǒng)。整個(gè)檢測過程只需要移液器、恒溫設(shè)備（水浴鍋）和相機(jī)（手機(jī)）即可完成。不僅大大降低了檢測成本，而且使得該技術(shù)不受環(huán)境和基礎(chǔ)設(shè)施的限制，可以用于邊遠(yuǎn)地區(qū)