基于工具酶信號放大的核酸等溫擴增檢測新方法研究.pdf

1、隨著分子生物學的發(fā)展，核酸擴增檢測技術(shù)得到迅速發(fā)展。PCR技術(shù)是目前廣泛應(yīng)用的核酸擴增檢測技術(shù)之一。但是，該技術(shù)對溫度條件依賴，需要復雜的變溫設(shè)備，以及實驗環(huán)境苛刻，難以滿足人們對簡便、快速、易操作的分析技術(shù)的需求。結(jié)合高效工具酶建立起來的等溫核酸擴增技術(shù)彌補了這些不足，在現(xiàn)場分析和應(yīng)急事件中表現(xiàn)出來的優(yōu)勢越來越明顯。
　　本論文中構(gòu)建了兩種基于工具酶的等溫核酸檢測新方法。在第二章中結(jié)合分子信標構(gòu)建了一種反應(yīng)快速，體系簡便的用于m

2、icroRNA檢測的方法，并且以microRNA Let-7a為靶標對方法進行了驗證。該方法通過帶有酶切位點的分子信標，在兩種工具酶的作用下利用鏈置換原理實現(xiàn)了檢測信號的兩重循環(huán)放大。利用此方法對不同濃度的Let-7a靶標進行檢測，在濃度范圍10zmol-1 fmol，表現(xiàn)出良好的線性關(guān)系，最低檢測限為8.5×10-15M，并且對人腦全RNA檢測中表現(xiàn)出較好的實用性。
　　針對目前大部分生物體內(nèi)核酸是以DNA雙鏈形式存在的情況，在

3、第三章中從設(shè)計的三個方案中優(yōu)選一種單引物核酸等溫擴增檢測雙鏈DNA方法。此方法首先借助切刻內(nèi)切酶對雙鏈DNA特異識別產(chǎn)生切口，利用具有鏈置換活性的聚合酶將雙鏈DNA線性轉(zhuǎn)換成單鏈DNA靶標，以擴增的單鏈靶標為模板設(shè)計單引物進行三重熒光信號的實時放大反應(yīng)。此方法以PBS質(zhì)粒DNA對實驗條件進行了優(yōu)化，在最優(yōu)條件下，實現(xiàn)了1.0×10-13 M的靶標的靈敏檢測。此方法中只需設(shè)計一條引物分子，方法體系簡單，反應(yīng)快速，以期能很好的應(yīng)用于進行現(xiàn)場