類胡蘿卜素含量和SCD基因表達(dá)水平對(duì)合浦珠母貝高溫適應(yīng)性的影響.pdf

1、合浦珠母貝（Pinctada fucata）是我國重要的海水經(jīng)濟(jì)珍珠貝類，主要分布在我國的廣東、廣西、海南等地。然而由于近年來海區(qū)夏季水溫不斷升高，合浦珠母貝的生長(zhǎng)存活受到了嚴(yán)重的影響。本研究為了探討類胡蘿卜素及其相關(guān)基因在合浦珠母貝耐高溫方面的作用，開展了高溫脅迫下不同類胡蘿卜素含量的合浦珠母貝體內(nèi)的抗氧化酶如超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）、過氧化氫酶（Catalase，CAT）、丙二醛（Malon

2、dialdehyde，MDA）含量以及總抗氧化能力（Total antioxidant capacity，TAC）和總類胡蘿卜素含量（Total carotenoids content，TCC）變化的研究，還通過分子生物學(xué)技術(shù)克隆獲得了合浦珠母貝PfSCD基因cDNA全長(zhǎng)，并研究了該基因在高溫脅迫下合浦珠母貝中的組織差異性表達(dá)及其與總類胡蘿卜素含量、總抗氧化能力的關(guān)聯(lián)性分析研究，初步證實(shí)類胡蘿卜素在合浦珠母貝中耐高溫進(jìn)程中發(fā)揮著積極作用

3、，為合浦珠母貝耐高溫品系的選育提供了新的方向。主要結(jié)果如下：
　　1.不同類胡蘿卜素含量的合浦珠母貝對(duì)高溫脅迫的免疫響應(yīng)
　　不同類胡蘿卜素含量的合浦珠母貝對(duì)高溫脅迫的免疫響應(yīng)研究表明，合浦珠母貝成活率隨溫度升高（26-34℃）和總類胡蘿卜素含量的降低而顯著降低（P＜0.05）；總類胡蘿卜素含量越高其成活率也就越高。總類胡蘿卜素含量和總抗氧化能力均隨脅迫時(shí)間的增加而降低（34℃）。相關(guān)性分析表明，總抗氧化能力與總類胡蘿卜素含

4、量呈顯著線性正相關(guān)（P＜0.01），成活率與總類胡蘿卜素含量和總量氧化能力均呈顯著S型相關(guān)（P＜0.01）。免疫響應(yīng)分析顯示總類胡蘿卜素含量高的家系的超氧化物歧化酶、過氧化氫酶活性以及丙二醛含量均顯著低于總類胡蘿卜素含量低的家系（P＜0.05），而且脅迫時(shí)間從0-96 h的變化范圍內(nèi)，以上指標(biāo)的變化顯著（P＜0.05）而且各個(gè)家系合浦珠母貝中的超氧化物歧化酶、過氧化氫酶活性以及丙二醛含量均在0-3 h內(nèi)升高，3-24 h內(nèi)降低，24-9

5、6 h再升高，并于24 h處達(dá)到最低即總類胡蘿卜素含量越高其超氧化物歧化酶、過氧化氫酶活性以及丙二醛含量就越低。上述研究說明，高溫脅迫下，合浦珠母貝體內(nèi)的類胡蘿卜素是機(jī)體的抗氧化系統(tǒng)的重要組成部分，對(duì)增強(qiáng)機(jī)體抗逆性方面發(fā)揮著一定積極作用，可作為抗逆品系選育的指標(biāo)。
　　2.合浦珠母貝硬脂酰輔酶A去飽和酶（stearoyl-CoA desaturase，SCD）基因的克隆、序列特征、進(jìn)化分析及其不同發(fā)育時(shí)期和組織的表達(dá)譜
　　

6、利用基因克隆技術(shù)獲得了合浦珠母貝的SCD基因并命名為PfSCD（Gene Bank登錄號(hào)：KY849348），其cDNA全長(zhǎng)為1576 bp，包含一個(gè)945 bp的開放閱讀框（Open reading frame, ORF）以及兩個(gè)非編碼區(qū)（Untranslated Regions，UTR）分別為：442 bp的3’-UTR和189 bp的5’-UTR。開放閱讀框編碼315個(gè)氨基酸，包含4個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域（Transmembrane dom

7、ains，TMs）、3個(gè)組氨酸模體（Histidine-box motifs，HMs）與其他物種的多重比對(duì)顯示具有高度同源性。此外還發(fā)現(xiàn)該序列具有5個(gè)功能結(jié)構(gòu)域，其中3個(gè)為與脂肪酸相關(guān)結(jié)構(gòu)域，包括1個(gè)脂肪酸羥化酶家族（Fatty acid hydroxylase superfamily，F(xiàn)A_hydroxylase）成員（36-122 aa）和2個(gè)脂肪酸去飽和酶家族（Fatty acid desaturase，F(xiàn)AD）成員（61-301

8、 aa，254-268 aa）。另外2個(gè)分別是位于195-215 aa的核算定位本地化（Bipartite nuclear localization signal profile，NLS_BP）結(jié)構(gòu)域和296-310 aa的未知功能（Protein of unknown function，DUF321）結(jié)構(gòu)域。進(jìn)化分析結(jié)果顯示合浦珠母貝PfSCD與太平洋牡蠣SCD首先聚為一支，然后再與其他軟體動(dòng)物聚為一支，表明合浦珠母貝的PfSCD與太

9、平洋牡蠣SCD等軟體動(dòng)物的同源性較高，與其他物種的同源性較低。實(shí)時(shí)熒光定量PCR（quantitative reverse transcription PCR，qRT-PCR）檢測(cè)結(jié)果表明PfSCD mRNA在合浦珠母貝的發(fā)育時(shí)期和組織中具有顯著差異，在變態(tài)幼蟲期、肝胰腺和擔(dān)輪幼蟲期、足中分別檢測(cè)到最大和最小值。
　　3.合浦珠母貝PfSCD mRNA組織差異性表達(dá)及其與總類胡蘿卜素含量（TCC）和總抗氧化能力（TAC）的相關(guān)性分

10、析
　　在高溫脅迫下和未脅迫下不同類胡蘿卜素含量的合浦珠母貝中PfSCD mRNA的實(shí)時(shí)表達(dá)量均具有組織差異性，且該基因在實(shí)驗(yàn)組（橘色組）和對(duì)照組（白色組）的肝胰腺、性腺以及閉殼肌足中表達(dá)量顯著高于外套膜、鰓和足（P＜0.05）。且同一脅迫時(shí)間下，相同組織的實(shí)驗(yàn)組PfSCD mRNA的實(shí)時(shí)表達(dá)量顯著高于對(duì)照組（P＜0.01）。在0-96 h的脅迫時(shí)間內(nèi)，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組PfSCD mRNA的實(shí)時(shí)表達(dá)量均隨著脅迫時(shí)間增加呈先上升后下降

11、的趨勢(shì)。不同的是實(shí)驗(yàn)組在12 h脅迫后PfSCD mRNA表達(dá)量達(dá)到最大值而對(duì)照組則是3 h脅迫后達(dá)到最大值。此外高溫脅迫下實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組不同組織中TAC和TCC隨脅迫時(shí)間的結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的肝胰腺、性腺以及閉殼肌組織中TAC和TCC均隨脅迫時(shí)間的增加呈馬蹄形的變化趨勢(shì)，即先下降后上升再下降，而其他組織如外套膜、鰓和足則不斷降低。同一脅迫時(shí)間下相同組織實(shí)驗(yàn)組的PfSCD mRNA的相對(duì)表達(dá)量顯著高于對(duì)照組（P＜0.01）。高溫脅