水稻感染RSV產(chǎn)生癥狀的蛋白質(zhì)組學(xué)分析及RNAi介導(dǎo)的抗RSV和RBSDV轉(zhuǎn)基因水稻研究.pdf

1、水稻是全世界重要的糧食作物。多種水稻病毒的侵染會給水稻生產(chǎn)帶來了嚴(yán)重危害，其中水稻條紋病毒(Rice stripe virus，RSV)和水稻黑條矮縮病毒(Rice black-streaked dwarf virus，RBSDV)是兩種重要的水稻病毒。感病水稻品種被RSV侵染后表現(xiàn)為心葉褪綠和捻轉(zhuǎn)、弧圈狀下垂并枯死，導(dǎo)致稻苗枯死。在水稻后期感染雖不枯死，但破壞水稻的生殖生長，造成抽穗不正常，嚴(yán)重影響水稻產(chǎn)量，但到目前為止，RSV誘導(dǎo)癥

2、狀產(chǎn)生的機理尚不清楚。此外，種植抗病品種是防治水稻病毒病害經(jīng)濟(jì)有效的策略，由于缺乏常規(guī)抗性種質(zhì)資源，獲得遺傳改良水稻種質(zhì)資源成為迫切的問題。
　　本研究利用基于iTRAQ(isobaric tags for relative and absolute quantitation)的比較蛋白質(zhì)組學(xué)分析了RSV侵染水稻前后的蛋白組差異，共鑒定了681個差異表達(dá)蛋白質(zhì)。生物信息學(xué)分析表明，在RSV侵染后水稻中表達(dá)下調(diào)70％以上差異蛋白質(zhì)主

3、要位于葉綠體，參與了葉綠素代謝過程。其中葉綠素合成相關(guān)的鎂離子螯合酶(magnesium chelatase)的三個亞基中的CHLI(magnesiumchelatase subunit I)和CHLD(magnesium chelatase subunit D)在mRNA和蛋白質(zhì)水平上均顯著減少，說明了RSV的侵染引起水稻葉片中的葉綠素合成受到抑制。在RSV侵染水稻后表達(dá)上調(diào)的蛋白質(zhì)中，感病葉片中天冬氨酸蛋白酶(Aspartic pr

4、otease，ASP)表達(dá)量明顯增高，而在水稻發(fā)育過程中，天冬氨酸蛋白酶可以觸發(fā)水稻細(xì)胞的程序性死亡，說明了RSV侵染誘導(dǎo)天冬氨酸蛋白酶的上調(diào)表達(dá)有可能是引起心葉枯死的原因。此外，RSV侵染后，Bet v1抗原家族蛋白質(zhì)、70kDa熱激蛋白質(zhì)(Hot shock protein70 kDa，HSP70)和超氧化物歧化酶觸發(fā)了植物的防御反應(yīng)。酵母雙雜交進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)了蛋白質(zhì)RAP與RSV的病害特異蛋白(SP)在細(xì)胞內(nèi)互作，為揭示水稻條紋葉枯病

5、癥狀形成的分子機制奠定了基礎(chǔ)。
　　在利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)獲得了由RSV外殼蛋白基因形成的發(fā)卡結(jié)構(gòu)(RSV-pc3-hpRNA)介導(dǎo)抗RSV的轉(zhuǎn)基因水稻材料的基礎(chǔ)上，sRNA(small RNA)印跡分析檢測到與pc3基因序列互補的21 nt-24 nt siRNAs（small interfering RNAs），而RNAi產(chǎn)生的21 nt-24 nt siRNAs具有抗病活性，說明了發(fā)卡結(jié)構(gòu)誘發(fā)了RNAi介導(dǎo)的抗病進(jìn)程，從而導(dǎo)致特異

6、性的siRNAs產(chǎn)生。與非轉(zhuǎn)基因水稻相比，轉(zhuǎn)基因水稻中AGO1B(Argonaute，AGO)、AGO1C、AGO1D、RDR4(RNA-dependent RNApolymerase，RDR)、SHL2(SHOOTLESS2)和DCL1A(Dicer-like，DCL)表達(dá)上調(diào)，而AGO1A、AGO18和SHO1(SHOOT ORGANIZATION1)表達(dá)下調(diào)。在RSV侵染后轉(zhuǎn)基因水稻中AGO2表達(dá)上調(diào)，而AGO1B、AGO1C、A

7、GO1D、AGO11、AGO16、RDR2、RDR4、 SHL2、 DCL1A、DCL1C和DCL3B表達(dá)下調(diào)。這說明了RSV侵染可改變轉(zhuǎn)基因水稻中AGOs、RDRs和DCLs表達(dá)量。
　　本研究將RSV外殼蛋白部分基因和RBSDV外殼蛋白部分基因組成基因（RSV-HCP-RBSDV-HS10），并將其基因插入到載體pMCG161上形成發(fā)卡結(jié)構(gòu)(RSV-HCP-RBSDV-HS10-hpRNA)，然后將發(fā)卡結(jié)構(gòu)構(gòu)建到改造過的載體p

8、CAMBIA1301（去除潮霉素基因）上，獲得載體pCAMBIA1301-DB。采用雙菌雙質(zhì)粒的共轉(zhuǎn)化法等轉(zhuǎn)基因技術(shù)獲得了轉(zhuǎn)基因材料。在此基礎(chǔ)上，田間抗病篩選轉(zhuǎn)基因材料獲得了抗RBSDV和RSV的轉(zhuǎn)基因水稻后代，并且利用PCR檢測到T2、T3和T4代轉(zhuǎn)基因水稻中只含有RSV-HCP-RBSDV-HS10基因不含潮霉素基因，從而獲得無標(biāo)記基因的抗RSV和RBSDV的轉(zhuǎn)基因水稻。Southern印跡分析明確了RSV-HCP-RBSDV-HS