利用雙T-DNA載體系統(tǒng)和RNAi培育抗水稻條紋病毒轉(zhuǎn)基因水稻.pdf

1、雙T-DNA載體系統(tǒng)是實(shí)現(xiàn)篩選完成后刪除選擇標(biāo)記基因的一種簡(jiǎn)便可行的方式。為獲得無(wú)選擇標(biāo)記抗水稻條紋病毒（RSV）的轉(zhuǎn)基因水稻，本研究通過(guò)構(gòu)建RNAi的雙T-DNA植物高效表達(dá)載體，采用根癌農(nóng)桿菌（EHA105）介導(dǎo)的方法轉(zhuǎn)化水稻，經(jīng)潮霉素抗性篩選、PCR 檢測(cè)及Southern、Northern雜交分析，獲得了無(wú)抗生素標(biāo)記的、高抗RSV水稻新種質(zhì)，為水稻抗RSV育種奠定了基礎(chǔ)。具體結(jié)果如下：
　　 1.以雙元載體pCAMBIA

2、1300 為基礎(chǔ)，加入高效表達(dá)的玉米泛素基因Ubi 啟動(dòng)子；
　　 然后以pBI121中的Nos3′＋T-DNA LB 為模板，設(shè)計(jì)引物（在引物的兩端加上合適的限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)，且在3′端加上T-DNA RB序列），PCR 擴(kuò)增得到含有Nos 終止子＋LB＋RB的cDNA片段，進(jìn)一步連接于重組載體中，獲得含有雙T-DNA的表達(dá)載體pCAMBIA1300DT。測(cè)序驗(yàn)證載體構(gòu)建的準(zhǔn)確性。繼而以RSV的SP基因?yàn)槟０?，PCR克隆SP基

3、因3′端400bp的cDNA片段，分別反向插入構(gòu)建的雙T-DNA的表達(dá)載體pCAMBIA1300DT中PLD基因內(nèi)含子的兩側(cè)，構(gòu)建了RNAi 植物表達(dá)載體pDTRSVSP。
　　 2.將構(gòu)建的植物表達(dá)載體pDTRSVSP 利用凍融法導(dǎo)入農(nóng)桿菌EHA105，轉(zhuǎn)化水稻豫粳6號(hào)及抗蟲、抗除草劑水稻新材料SK。經(jīng)潮霉素篩選、PCR 檢測(cè)，分別獲得豫粳6號(hào)轉(zhuǎn)基因植株20 株和SK 轉(zhuǎn)基因植株18 株。PCR 檢測(cè)的結(jié)果表明hpt基因和SP

4、基因的共轉(zhuǎn)化率為44.7％。
　　 3.含hpt基因和SP基因的T0 代轉(zhuǎn)基因植株自交后，獲得的T1 代轉(zhuǎn)基因株系，分子檢測(cè)表明有13.08％的植株只含有SP基因；這些植株進(jìn)一步自交，在T2 代獲得了無(wú)hpt基因、而SP基因純合穩(wěn)定的豫粳6號(hào)轉(zhuǎn)基因株系6個(gè)、SK 轉(zhuǎn)基因株系5個(gè)。
　　 4.對(duì)獲得的11個(gè)僅含目的基因的T2 代純合株系進(jìn)行RSV 抗性鑒定，結(jié)果顯示，有3個(gè)豫粳6號(hào)轉(zhuǎn)基因株系和2個(gè)SK 轉(zhuǎn)基因株系表現(xiàn)為高抗