抗RSV轉(zhuǎn)基因水稻中外源基因的染色體定位及其對水稻基因表達(dá)的影響.pdf

1、目前，轉(zhuǎn)基因水稻的研究在我國發(fā)展迅速，此中研發(fā)的一些抗病、抗蟲轉(zhuǎn)基因水稻品系已經(jīng)進(jìn)入申請生產(chǎn)種植安全證書階段，但因為轉(zhuǎn)基因生物安全的問題，至今仍少有品系批準(zhǔn)商業(yè)化生產(chǎn)應(yīng)用，國際上許多國家的轉(zhuǎn)基因生物安全管理法規(guī)都有對轉(zhuǎn)基因植物進(jìn)行安全評價的要求。本研究，通過Tail-PCR、Genome walking和Southern雜交的方法對抗RSV轉(zhuǎn)基因水稻中插入的T-DNA進(jìn)行染色體定位，并通過數(shù)字基因表達(dá)譜測序和Swath測序研究KRSV轉(zhuǎn)

2、基因水稻與其受體品種間基因表達(dá)的差異，對其進(jìn)行安全評價，從而為抗RSV轉(zhuǎn)基因水稻的推廣奠定基礎(chǔ)。研究結(jié)果和主要結(jié)論如下:
　　(1)利用HindⅢ和EcoRⅠ對抗RSV轉(zhuǎn)基因水稻KRSV-1和非轉(zhuǎn)基因水稻基因組DNA進(jìn)行單酶切，經(jīng)過Southem雜交，顯示轉(zhuǎn)基因材料均顯示一條帶，而非轉(zhuǎn)基因材料沒有條帶，表明KRSV-1中的外源基因為單拷貝。
　　(2)利用HiTail-PCR和Genome walking的方法擴(kuò)增KRSV-

3、1中T-DNA邊界的側(cè)翼序列。結(jié)果顯示:T-DNA左邊界是染色體2的序列，右邊界是染色體8的序列，T-DNA攜帶1.6kb大小的染色體8上的DNA片段易位到染色體2上，插入于染色體2的22443520-22443553位點之間，在整合位點處伴隨著染色體2上32個核苷酸缺失的現(xiàn)象，以及一個3bp的填充序列5'GCA。
　　(3) Genome walking的結(jié)果表明，隨T-DNA易位的序列在染色體8上得以恢復(fù)。經(jīng)Blast分析:染

4、色體2的斷點處位于兩個基因之間;發(fā)生易位的染色體8序列中，16434112-16434890區(qū)間是假基因，16435494-16435712區(qū)間位于編碼某假定蛋白的基因中。
　　(4)提取分蘗期水稻葉片mRNA，利用DGE測序分析，KRSV-1與香稻9407葉片mRNA表達(dá)共有7434條具有顯著差異(P＜=0.05)。轉(zhuǎn)基因水稻與野生型之間mRNA表達(dá)差異分布在全部12條染色體上，并未集中在2號染色體插入位點周圍。推測外源基因轉(zhuǎn)入

5、水稻過程中出現(xiàn)了非預(yù)期效應(yīng)。進(jìn)一步對mRNA數(shù)據(jù)進(jìn)行篩查，未發(fā)現(xiàn)表達(dá)新過敏原蛋白和致毒蛋白的mRNA。
　　(5)提取抗RSV轉(zhuǎn)基因水稻和其受體稻的種子蛋白，利用SWATH技術(shù)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，兩種水稻種子共標(biāo)記定量蛋白1887個，其中差異蛋白共357個。轉(zhuǎn)基因水稻中的熱敏蛋白具極顯著差異，20s、40s、60s核糖體蛋白、ATP轉(zhuǎn)運合成相關(guān)蛋白、幾種伴侶蛋白、谷蛋白、組蛋白和幾種病原菌誘導(dǎo)防御反應(yīng)蛋白含量與野生型水稻相比具有較大差別