棉花草甘膦自然抗性評(píng)價(jià)及抗性基因源挖掘研究.pdf

1、自1940年第一例除草劑2，4-D問(wèn)世至今，不斷出現(xiàn)各種作用機(jī)制的除草劑，目前種類繁多。1974年商業(yè)化的草甘膦具有廣諾、滅生性，殺草能力強(qiáng)，副作用小，在除草劑中獨(dú)樹一幟，且在全世界范圍內(nèi)被廣泛使用。發(fā)展轉(zhuǎn)基因抗草甘膦作物很大程度上方便了草甘膦除草，但存在轉(zhuǎn)基因安全隱患。因此，在植棉過(guò)程中，從現(xiàn)有棉花資源挖掘內(nèi)源抗草甘膦基因源，并用于棉花育種，可有效解決諸多問(wèn)題。棉花種質(zhì)資源蘊(yùn)含許多優(yōu)異基因，鑒于此，本文旨在對(duì)野生棉、半野生棉和亞洲棉種

2、質(zhì)材料草甘膦自然抗性進(jìn)行鑒定和評(píng)價(jià)，分析半野生棉極端反應(yīng)材料的epsps基因序列及其表達(dá)量，闡明抗性與epsps基因的關(guān)系，并通過(guò)全基因組關(guān)聯(lián)分析方法，從數(shù)量性狀思路挖掘棉花中抗草甘膦的基因源。研究結(jié)果如下:
　　1.棉花種質(zhì)材料草甘膦自然抗性評(píng)價(jià)及比較分析
　　分別采用嫩枝噴灑法和棉花葉片棉球定位法，對(duì)26個(gè)野生棉種共134株和7個(gè)半野生棉種系共403份，及收集自5個(gè)地區(qū)的亞洲棉共101份材料，進(jìn)行了草甘膦自然抗性的鑒定和

3、評(píng)價(jià)，并對(duì)其抗性水平進(jìn)行了比較分析。通過(guò)田間鑒定試驗(yàn)，獲得了一個(gè)棉花除草劑自然抗性鑒定的方法，擬定了相應(yīng)抗性水平的評(píng)價(jià)參考標(biāo)準(zhǔn)，并分別篩選出1份、2份和5份高抗的野生棉、半野生棉和亞洲棉材料，16份和1份高感的野生棉和半野生棉材料。分別以苗期、蕾期和花鈴期常規(guī)栽培棉中棉所12的草甘膦致死濃度0.1％、0.15％和0.25％為標(biāo)準(zhǔn)，采用噴灑法對(duì)高抗和高感半野生棉材料進(jìn)行田間抗性鑒定，最終得到穩(wěn)定的抗和敏感材料各1份。同時(shí)，比較分析發(fā)現(xiàn)鑒定

4、材料抗性水平多樣性依次是:野生棉＞半野生棉＞亞洲棉;鑒定材料的整體抗性水平依次是:亞洲棉＞半野生棉＞野生棉。對(duì)棉花種質(zhì)資源的草甘膦抗性進(jìn)行評(píng)價(jià)，有助于全面系統(tǒng)地了解棉花的草甘膦抗性，為研究棉花的草甘膦抗性機(jī)制及內(nèi)源抗性基因源的挖掘奠定材料基礎(chǔ)，同時(shí)也指導(dǎo)抗草甘膦棉花育種。
　　2.半野生棉內(nèi)源epsps基因序列及表達(dá)量分析
　　以sad1基因?yàn)閰⒖蓟颍捎妹仙蕉脊巨D(zhuǎn)基因抗草甘膦棉花的基因序列特異引物，對(duì)半野生棉極端材料進(jìn)

5、行轉(zhuǎn)基因成分檢測(cè)，證明篩選出的極端材料不舍轉(zhuǎn)抗草甘膦基因成分。采用陸地棉（珂字棉312）中epsps基因全長(zhǎng)引物對(duì)半野生棉材料DNA進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)測(cè)序并翻譯成氨基酸序列，比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)半野生棉epsps基因沒(méi)有特異的氨基酸突變位點(diǎn)，說(shuō)明半野生棉材料抗性的產(chǎn)生不是由epsps基因突變而致。對(duì)材料噴施0.2％的草甘膦溶液，48 h后取樣，采用RT-PCR方法檢測(cè)epsps基因表達(dá)量變化，發(fā)現(xiàn)革甘膦處理后，epsps基因表達(dá)量無(wú)明顯變化，

6、這表明半野生棉草甘膦抗性可能不是由epsps基因引起，而是其它抗性機(jī)制而致，有待以新的思路去研究。
　　3.關(guān)聯(lián)分析方法挖掘半野生棉草甘膦抗性基因源
　　2013年，在三個(gè)不同環(huán)境下，對(duì)202份半野生棉材料進(jìn)行與草甘膦抗性相關(guān)表型的測(cè)定，包括莽草酸含量和地上部分相對(duì)干重，并與覆蓋全基因組的182對(duì)SSR多態(tài)性標(biāo)記的基因型數(shù)據(jù)進(jìn)行全基因組關(guān)聯(lián)分析，共檢測(cè)到72個(gè)與草甘膦抗性相關(guān)的位點(diǎn)，其中，48個(gè)和41個(gè)位點(diǎn)分別與莽草酸含量和

7、地上部分相對(duì)干重顯著相關(guān)?；诔晒﹃P(guān)聯(lián)的SSR引物序列和中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所公布的雷蒙德氏棉(G.raimondii)、亞洲棉(G.arboreum L)和陸地棉（G.hirsutum）全基因組測(cè)序數(shù)據(jù)，共得到87條候選基因，包括亞洲棉中的21條，雷蒙德氏棉中的24條和陸地棉中的42條。以可可（Theobroma cacao）為模式植物，將這些基因在KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行注釋，探索相關(guān)的代謝通路，其中，ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族可能與草甘膦抗