棉花草甘膦自然抗性評價及抗性基因源挖掘研究.pdf

1、自1940年第一例除草劑2，4-D問世至今，不斷出現各種作用機制的除草劑，目前種類繁多。1974年商業(yè)化的草甘膦具有廣諾、滅生性，殺草能力強，副作用小，在除草劑中獨樹一幟，且在全世界范圍內被廣泛使用。發(fā)展轉基因抗草甘膦作物很大程度上方便了草甘膦除草，但存在轉基因安全隱患。因此，在植棉過程中，從現有棉花資源挖掘內源抗草甘膦基因源，并用于棉花育種，可有效解決諸多問題。棉花種質資源蘊含許多優(yōu)異基因，鑒于此，本文旨在對野生棉、半野生棉和亞洲棉種

2、質材料草甘膦自然抗性進行鑒定和評價，分析半野生棉極端反應材料的epsps基因序列及其表達量，闡明抗性與epsps基因的關系，并通過全基因組關聯分析方法，從數量性狀思路挖掘棉花中抗草甘膦的基因源。研究結果如下:
　　1.棉花種質材料草甘膦自然抗性評價及比較分析
　　分別采用嫩枝噴灑法和棉花葉片棉球定位法，對26個野生棉種共134株和7個半野生棉種系共403份，及收集自5個地區(qū)的亞洲棉共101份材料，進行了草甘膦自然抗性的鑒定和

3、評價，并對其抗性水平進行了比較分析。通過田間鑒定試驗，獲得了一個棉花除草劑自然抗性鑒定的方法，擬定了相應抗性水平的評價參考標準，并分別篩選出1份、2份和5份高抗的野生棉、半野生棉和亞洲棉材料，16份和1份高感的野生棉和半野生棉材料。分別以苗期、蕾期和花鈴期常規(guī)栽培棉中棉所12的草甘膦致死濃度0.1％、0.15％和0.25％為標準，采用噴灑法對高抗和高感半野生棉材料進行田間抗性鑒定，最終得到穩(wěn)定的抗和敏感材料各1份。同時，比較分析發(fā)現鑒定

4、材料抗性水平多樣性依次是:野生棉＞半野生棉＞亞洲棉;鑒定材料的整體抗性水平依次是:亞洲棉＞半野生棉＞野生棉。對棉花種質資源的草甘膦抗性進行評價，有助于全面系統地了解棉花的草甘膦抗性，為研究棉花的草甘膦抗性機制及內源抗性基因源的挖掘奠定材料基礎，同時也指導抗草甘膦棉花育種。
　　2.半野生棉內源epsps基因序列及表達量分析
　　以sad1基因為參考基因，采用孟山都公司轉基因抗草甘膦棉花的基因序列特異引物，對半野生棉極端材料進

5、行轉基因成分檢測，證明篩選出的極端材料不舍轉抗草甘膦基因成分。采用陸地棉（珂字棉312）中epsps基因全長引物對半野生棉材料DNA進行擴增，擴增產物經測序并翻譯成氨基酸序列，比對分析發(fā)現半野生棉epsps基因沒有特異的氨基酸突變位點，說明半野生棉材料抗性的產生不是由epsps基因突變而致。對材料噴施0.2％的草甘膦溶液，48 h后取樣，采用RT-PCR方法檢測epsps基因表達量變化，發(fā)現革甘膦處理后，epsps基因表達量無明顯變化，

6、這表明半野生棉草甘膦抗性可能不是由epsps基因引起，而是其它抗性機制而致，有待以新的思路去研究。
　　3.關聯分析方法挖掘半野生棉草甘膦抗性基因源
　　2013年，在三個不同環(huán)境下，對202份半野生棉材料進行與草甘膦抗性相關表型的測定，包括莽草酸含量和地上部分相對干重，并與覆蓋全基因組的182對SSR多態(tài)性標記的基因型數據進行全基因組關聯分析，共檢測到72個與草甘膦抗性相關的位點，其中，48個和41個位點分別與莽草酸含量和

7、地上部分相對干重顯著相關?；诔晒﹃P聯的SSR引物序列和中國農業(yè)科學院棉花研究所公布的雷蒙德氏棉(G.raimondii)、亞洲棉(G.arboreum L)和陸地棉（G.hirsutum）全基因組測序數據，共得到87條候選基因，包括亞洲棉中的21條，雷蒙德氏棉中的24條和陸地棉中的42條。以可可（Theobroma cacao）為模式植物，將這些基因在KEGG數據庫中進行注釋，探索相關的代謝通路，其中，ABC轉運蛋白家族可能與草甘膦抗