柱花草誘導抗性及抗病基因類似物的表達特性.pdf

1、柱花草是熱帶亞熱帶地區(qū)種植的優(yōu)良豆科牧草。熱研二號柱花草1973年由國際熱帶農業(yè)中心(CIAT)農藝學家采集并且保存于種子庫中,編號為CIAT184。柱花草炭疽病(Styloanthraenose)為嚴重危害柱花草的生產和推廣的主要病害。
　　 本研究從廣西南寧畜牧研究所采集病樣(病葉及病莖),于實驗室進行單孢分離、純化培養(yǎng),得到單孢分離菌株命名為GX021001,并對該菌株致病性進行鑒定。該菌屬半知菌亞門刺盤孢屬的膠孢炭疽菌[

2、Colletotrichumgloeosporioides(Penz.)Penz.andSacc],并且3個供試的柱花草品種侵染該菌株時的抗病癥狀表現與它們的抗病性相符。
　　 本研究采用0.01mmol/L和0.5mmol/L兩個水楊酸濃度,統(tǒng)計水楊酸誘導柱花草對炭疽病抗性的病情指數,并測定POD、CAT、PPO的酶活性,分析水楊酸對柱花草抗炭疽病相關酶活性的影響。研究結果表明:用0.01mmol/L,水楊酸處理的柱花草的病情

3、指數為42.0,而用蒸餾水處理的柱花草的病情指數為56.0,說明水楊酸具有誘導抗病效果,并且濃度為0.01mmol/L的水楊酸的抗病效果較好。接種炭疽菌72h后,0.01mmol/L水楊酸處理的POD活性和0.5mmol/L水楊酸處理的POD的活性分別是對照的0.47倍、0.57倍。接種72h后,水楊酸處理的POD離子態(tài)和共價態(tài)活性也明顯低于對照,說明了水楊酸對POD有抑制作用。濃度為0.01mmol/L的水楊酸的CAT和濃度為0.5m

4、mol/L的水楊酸的CAT活性分別是對照的0.44倍,0.82倍,說明用水楊酸處理能有效抑制過氧化氫酶的活性。濃度為0.5mmol/L的水楊酸的PPO是對照的1.11倍,而濃度為0.01mmol/L的水楊酸的PPO為對照的2.56倍,說明了水楊酸處理誘導了防衛(wèi)反應中關鍵酶PPO的產生。
　　 本研究以柱花草葉片為材料,比較了SDS/酚抽提法、CTAB法、Trizol試劑盒和柱式植物RNAom試劑盒法提取柱花草總RNA的質量和純度

5、。結果表明:改良CTAB法和柱式植物RNAom試劑盒法提取的RNA的OD260nm/OD280nm分別是1.85和1.93,OD260nm/OD230nm均大于2.0。凝膠電泳結果表明,改良CTAB法有28SrRNA和18SrRNA兩條清晰的條帶,且無降解;柱式植物RNAom試劑盒法有四條清晰的條帶且無降解。其他兩種方法獲得的RNA品質較差,有降解和彌散現象。將改良CTAB法和柱式植物RNAout試劑盒法提取的RNA逆轉錄成cDNA,c

6、DNA能擴增出一條清晰的β-actin基因片段,進一步證明了改良CTAB法和柱式植物RNAout試劑盒法提取的總RNA具有很高的純度,其中柱式植物RNAout試劑盒法的效果好于改良CTAB法。
　　 本研究利用半定量RT-PCR技術,以β-actin基因為看家基因,根據本實驗室已經測序的基因組NBS類抗病基因類似物(RGA)片段設計引物,從柱花草cDNA中擴增到目的基因。并探討看家基因與目的基因的最佳Mg2+濃度,最佳模板量和平

7、臺期循環(huán)數以及同管擴增與異管擴增,得出結論看家基因與目的基因的最適Mg2+濃度均為3mmol/L,看家基因的最佳循環(huán)次數為28,目的基因的最適循環(huán)次數為30,并通過分組試驗確定采用異管擴增。柱花草植株分別噴施1×106個孢子/mL的炭疽菌溶液及0.01mmol/L的水楊酸溶液做半定量PCR分析,以噴施蒸餾水為對照,分別提取噴施1d、2d、3d、4d、5d的植株葉片RNA,按照半定量RT-PCR技術原則擴增看家基因與目的基因,比較條帶的完