柱花草誘導(dǎo)抗性及抗病基因類似物的表達(dá)特性.pdf

1、柱花草是熱帶亞熱帶地區(qū)種植的優(yōu)良豆科牧草。熱研二號(hào)柱花草1973年由國際熱帶農(nóng)業(yè)中心(CIAT)農(nóng)藝學(xué)家采集并且保存于種子庫中,編號(hào)為CIAT184。柱花草炭疽病(Styloanthraenose)為嚴(yán)重危害柱花草的生產(chǎn)和推廣的主要病害。
　　 本研究從廣西南寧畜牧研究所采集病樣(病葉及病莖),于實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行單孢分離、純化培養(yǎng),得到單孢分離菌株命名為GX021001,并對(duì)該菌株致病性進(jìn)行鑒定。該菌屬半知菌亞門刺盤孢屬的膠孢炭疽菌[

2、Colletotrichumgloeosporioides(Penz.)Penz.andSacc],并且3個(gè)供試的柱花草品種侵染該菌株時(shí)的抗病癥狀表現(xiàn)與它們的抗病性相符。
　　 本研究采用0.01mmol/L和0.5mmol/L兩個(gè)水楊酸濃度,統(tǒng)計(jì)水楊酸誘導(dǎo)柱花草對(duì)炭疽病抗性的病情指數(shù),并測(cè)定POD、CAT、PPO的酶活性,分析水楊酸對(duì)柱花草抗炭疽病相關(guān)酶活性的影響。研究結(jié)果表明:用0.01mmol/L,水楊酸處理的柱花草的病情

3、指數(shù)為42.0,而用蒸餾水處理的柱花草的病情指數(shù)為56.0,說明水楊酸具有誘導(dǎo)抗病效果,并且濃度為0.01mmol/L的水楊酸的抗病效果較好。接種炭疽菌72h后,0.01mmol/L水楊酸處理的POD活性和0.5mmol/L水楊酸處理的POD的活性分別是對(duì)照的0.47倍、0.57倍。接種72h后,水楊酸處理的POD離子態(tài)和共價(jià)態(tài)活性也明顯低于對(duì)照,說明了水楊酸對(duì)POD有抑制作用。濃度為0.01mmol/L的水楊酸的CAT和濃度為0.5m

4、mol/L的水楊酸的CAT活性分別是對(duì)照的0.44倍,0.82倍,說明用水楊酸處理能有效抑制過氧化氫酶的活性。濃度為0.5mmol/L的水楊酸的PPO是對(duì)照的1.11倍,而濃度為0.01mmol/L的水楊酸的PPO為對(duì)照的2.56倍,說明了水楊酸處理誘導(dǎo)了防衛(wèi)反應(yīng)中關(guān)鍵酶PPO的產(chǎn)生。
　　 本研究以柱花草葉片為材料,比較了SDS/酚抽提法、CTAB法、Trizol試劑盒和柱式植物RNAom試劑盒法提取柱花草總RNA的質(zhì)量和純度

5、。結(jié)果表明:改良CTAB法和柱式植物RNAom試劑盒法提取的RNA的OD260nm/OD280nm分別是1.85和1.93,OD260nm/OD230nm均大于2.0。凝膠電泳結(jié)果表明,改良CTAB法有28SrRNA和18SrRNA兩條清晰的條帶,且無降解;柱式植物RNAom試劑盒法有四條清晰的條帶且無降解。其他兩種方法獲得的RNA品質(zhì)較差,有降解和彌散現(xiàn)象。將改良CTAB法和柱式植物RNAout試劑盒法提取的RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA,c

6、DNA能擴(kuò)增出一條清晰的β-actin基因片段,進(jìn)一步證明了改良CTAB法和柱式植物RNAout試劑盒法提取的總RNA具有很高的純度,其中柱式植物RNAout試劑盒法的效果好于改良CTAB法。
　　 本研究利用半定量RT-PCR技術(shù),以β-actin基因?yàn)榭醇一?根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)測(cè)序的基因組NBS類抗病基因類似物(RGA)片段設(shè)計(jì)引物,從柱花草cDNA中擴(kuò)增到目的基因。并探討看家基因與目的基因的最佳Mg2+濃度,最佳模板量和平

7、臺(tái)期循環(huán)數(shù)以及同管擴(kuò)增與異管擴(kuò)增,得出結(jié)論看家基因與目的基因的最適Mg2+濃度均為3mmol/L,看家基因的最佳循環(huán)次數(shù)為28,目的基因的最適循環(huán)次數(shù)為30,并通過分組試驗(yàn)確定采用異管擴(kuò)增。柱花草植株分別噴施1×106個(gè)孢子/mL的炭疽菌溶液及0.01mmol/L的水楊酸溶液做半定量PCR分析,以噴施蒸餾水為對(duì)照,分別提取噴施1d、2d、3d、4d、5d的植株葉片RNA,按照半定量RT-PCR技術(shù)原則擴(kuò)增看家基因與目的基因,比較條帶的完