轉(zhuǎn)G2--aroA基因抗草甘膦水稻的獲得及G2--EPSPS蛋白拆分重組后的草甘膦抗性分析.pdf

1、水稻是世界上重要的糧食作物，在我國(guó)國(guó)民經(jīng)濟(jì)中占有重要地位。稻田除草貫穿于水稻的整個(gè)生產(chǎn)過程中，增加了相當(dāng)一部分勞動(dòng)力和經(jīng)濟(jì)投入?；瘜W(xué)除草劑的使用為降低水稻生產(chǎn)成本具有非常重要的意義，草甘膦是廣譜、高效、低毒、廉價(jià)的內(nèi)吸傳導(dǎo)型除草劑，但因其對(duì)水稻也具有致死作用而無法在稻田大面積使用。通過基因工程手段培育具有草甘膦抗性的轉(zhuǎn)基因水稻不僅能夠節(jié)約稻田除草的成本、減少勞動(dòng)力投入、降低除草劑使用量還能提高農(nóng)民收入具有非常好的應(yīng)用前景。但是隨著轉(zhuǎn)基因

2、技術(shù)的不斷發(fā)展，轉(zhuǎn)基因安全性問題也受到廣泛關(guān)注，尤其是花粉介導(dǎo)的的外源基因飄流問題，一直是公眾和部分科研界人士的關(guān)注熱點(diǎn)，通過基因拆分技術(shù)能夠在很大程度上降低轉(zhuǎn)基因飄流的頻率。因此，本研究將表達(dá)G2-EPSPS蛋白的G2-aroA基因轉(zhuǎn)入水稻，培育抗草甘膦轉(zhuǎn)基因水稻，探索轉(zhuǎn)G2-aroA基因水稻對(duì)草甘膦的抗性。并通過基因拆分技術(shù)研究通過Intein介導(dǎo)拆分的G2-EPSPS蛋白在轉(zhuǎn)基因水稻雜交后代中重新組裝后的草甘膦抗性與轉(zhuǎn)完整G2-a

3、roA基因水稻抗性的區(qū)別，研究拆分后蛋白質(zhì)重新組裝效率，為基因拆分技術(shù)限控水稻基因飄流的應(yīng)用提供數(shù)據(jù)支撐。研究結(jié)果如下:
　　1.抗草甘膦水稻的培育及轉(zhuǎn)化事件特異性檢測(cè)方法的建立
　　1)將轉(zhuǎn)基因水稻G2-6、G2-7與非轉(zhuǎn)基因?qū)φ罩谢?1分別浸入到0、50、100ppm草甘膦溶液中，進(jìn)行萌芽期草甘膦耐受程度測(cè)試，發(fā)現(xiàn)50ppm下中花11的萌發(fā)受到明顯抑制，在100ppm下，萌出的胚芽很快腐爛。與之相比，G2-6和G2-7在

4、50ppm和100ppm下的生長(zhǎng)均與對(duì)照組無明顯差異，說明G2-aroA基因的轉(zhuǎn)入使水稻獲得了草甘膦抗性，且50ppm的草甘膦可以作為萌芽期草甘膦水稻快速篩選的篩選濃度。
　　2)通過苗期噴施草甘膦實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)中花11在1000ppm草甘膦濃度下即枯萎死亡，而G2-6和G2-7在20000ppm下依然能夠存活，說明G2-aroA基因至少將水稻苗期的草甘膦抗性提高了20倍。通過測(cè)量噴施后株高，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，發(fā)現(xiàn)噴施草甘膦后地上部分的

5、生長(zhǎng)受到一定抑制，3000ppm和5000ppm濃度處理下生長(zhǎng)高度無顯著差異，但顯著低于對(duì)照組，8000ppm-20000ppm處理組生長(zhǎng)高度無顯著差異，顯著低于3000ppm和5000ppm處理組。
　　3)通過在水培溶液中加入不同濃度的草甘膦，引入草甘膦計(jì)量反應(yīng)曲線，分析G2-6、G2-7和中花11不同處理組的株高，判定株高對(duì)草甘膦濃度的響應(yīng)曲線，計(jì)算株高被抑制程度達(dá)到50％時(shí)的草甘膦濃度，即I50。中花11的I50為0.93

6、、G2-6的I50為96.4、G2-7的I50為114.07，即G2-6和G2-7的草甘膦抗性分別提高了104和123倍。
　　4)擴(kuò)增G2-6的T-DNA5'端側(cè)翼序列，獲得該轉(zhuǎn)化事件的外源基因正向插入到水稻8號(hào)染色體的23685037處。下載插入位點(diǎn)上下游基因組序列，設(shè)計(jì)特異引物G2-OsF，G2-OsR，在T-DNA的LB附近序列上設(shè)計(jì)下游引物G2-TR，建立了G2-6轉(zhuǎn)化事件特異性PCR檢測(cè)體系，以及三引物法檢測(cè)G2-6純

7、合系植株的PCR體系。
　　2.基因拆分技術(shù)在水稻中的應(yīng)用效果
　　1)通過側(cè)翼序列和拷貝數(shù)分析，篩選到外源基因插入到2號(hào)染色體的En-1，En-12，Ec-26，以及插入到6號(hào)染色體的Ec-22四個(gè)單拷貝轉(zhuǎn)化事件作為后續(xù)研究的植物材料。
　　2)分別以En-1和En-12為母本，以Ec-22和Ec-26為父本，通過人工雜交獲得EPSPSn-In和Ic-EPSPSc插入到同源染色體的轉(zhuǎn)基因水稻雜交系En-1/Ec-26

8、，En-12/Ec-26，獲得EPSPSn-In和Ic-EPSPSc插入到非同源染色體的轉(zhuǎn)基因水稻雜交系En-12/Ec-22。
　　3)通過苗期噴施草甘膦實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因水稻雜交系En-1/Ec-26能夠耐受5000ppm的草甘膦，但是其株高的生長(zhǎng)速度顯著低于未處理組。
　　4)通過在水培溶液中加入不同濃度的草甘膦，分析轉(zhuǎn)基因水稻雜交系En-1/Ec-26、En-12/Ec-26、En-12/Ec-22、轉(zhuǎn)完整基因的水稻G

9、2-6、G2-7和中花11不同處理組的株高，通過計(jì)量反應(yīng)曲線計(jì)算I50，En-1/Ec-26的I50為23.78，En-12/Ec-22的I50為20.62，En-12/Ec-26的I50為17.81，與中花11相比分別提高了25.6倍、22.1倍和17.81倍，與G2-6和G2-7相比草甘膦耐受能力降低的程度在4-6.8倍之間。
　　5)大田中噴施草甘膦分析不同類型轉(zhuǎn)基因植株的草甘膦抗性，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因水稻雜交后代與G2-6在噴施2

10、000ppm草甘膦時(shí)表現(xiàn)出一致的抗性，En-1，En-12，Ec-22，Ec-26同中花11在噴施草甘膦十天后枯萎死亡。說明G2-EPSPS蛋白拆分后的兩個(gè)片段獨(dú)立存在時(shí)不具有抗草甘膦的功能活性;在雜交材料En-1/Ec-26、En-12/Ec-26和En-12/Ec-22中，拆分后的G2-aroA基因表達(dá)的蛋白片段被，sp DnaE Intein介導(dǎo)發(fā)生了剪接反應(yīng)，產(chǎn)生了有功能的EPSPS蛋白，抗性株率達(dá)到100％。
　　6)總