草甘膦抗性候選基因的克隆與表達(dá)研究.pdf

1、草甘膦是是由美國(guó)孟山都公司開發(fā)的在世界農(nóng)業(yè)中具有跨時(shí)代意義的一種高效、低毒、廣譜、內(nèi)吸的非選擇性滅生除草劑，其市場(chǎng)化應(yīng)用不僅提高了農(nóng)業(yè)生產(chǎn)率，為農(nóng)民帶來(lái)了極大便利，也改變了現(xiàn)代農(nóng)業(yè)的發(fā)展方向。草甘膦通過(guò)莖葉吸收后傳導(dǎo)到植物各部位能有效防除絕大多數(shù)一年生及多年生雜草，但由于其具有廣譜和非選擇性的特點(diǎn)，在殺死雜草的同時(shí)對(duì)農(nóng)作物也具有毒害作用?？共莞熟⒆魑锏姆N植，不僅能夠使草甘膦有效防除雜草，提高勞動(dòng)生產(chǎn)力，降低種植成本，同時(shí)能夠保護(hù)作物免受

2、草甘膦的傷害，具有重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。因此，抗草甘膦基因的挖掘和篩選對(duì)抗草甘膦作物新品種的培育具有重要意義。
　　 從抗草甘膦微生物中分離抗性基因并轉(zhuǎn)入作物中是培育抗草甘膦品種的一個(gè)十分重要的途徑。本研究從受草甘膦極端污染的污泥中篩選到一株高抗草甘膦真菌串珠狀赤霉（Gibberella moniliformis），對(duì)其進(jìn)行了形態(tài)學(xué)鑒定、生物學(xué)分類和培養(yǎng)條件的優(yōu)化，構(gòu)建了菌株的基因組文庫(kù)，首次分離到抗草甘膦基因EPSPS，并經(jīng)原核表達(dá)

3、驗(yàn)證其具有抗草甘膦功能。同時(shí)分離出aroM基因，并對(duì)其各組成基因進(jìn)行草甘膦誘導(dǎo)后的熒光定量表達(dá)分析，旨在為培育轉(zhuǎn)基因抗草甘膦作物提供抗性基因資源。
　　 主要研究結(jié)果如下:
　　 1.利用瓶培養(yǎng)富集技術(shù)，將一株抗草甘膦濃度高達(dá)600 mM的真菌從生產(chǎn)草甘膦工廠排污口的污泥中篩選出，此菌株被命名為ND-H。結(jié)合形態(tài)學(xué)觀察、18S rDNA序列多樣性分析和5.8S rDNA-ITS序列多樣性分析，將ND-H鑒定為串珠狀赤霉（

4、Gibberella moniliformis）。采取稱干重法測(cè)定菌株隨時(shí)間變化和不同培育條件下的生長(zhǎng)量，表明其在液體培養(yǎng)基中的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期為24 h-84 h，最適生長(zhǎng)溫度為28℃，最適環(huán)境pH值為7.0。
　　 2.用CTAB法提取并純化了菌株ND-H的基因組DNA，構(gòu)建基因組文庫(kù)，原始文庫(kù)滴度為2.25×106cfu/mL，庫(kù)容為2.25×106 cfu，插入片段范圍為1 kb-3 kb，主要集中在1 kb附近，經(jīng)鑒定文庫(kù)質(zhì)

5、量符合建庫(kù)標(biāo)準(zhǔn)，可用于抗性基因篩選。成功篩選到EPSPS基因，系統(tǒng)發(fā)育樹進(jìn)化研究表明該基因?qū)儆贓PSPSⅠ型基因（草甘膦天然敏感型EPSP合酶）。
　　 3.將EPSPS轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21(DE3)中，使大腸桿菌對(duì)草甘膦的抗性從原來(lái)的40 mM提高到80 mM，高于空質(zhì)粒陰性對(duì)照，這說(shuō)明重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌后在其體內(nèi)表達(dá)成功，提高了大腸桿菌對(duì)草甘膦的抗性。
　　 4.克隆得到了串珠狀赤霉aroM基因，核苷酸序列長(zhǎng)度為4