甘藍型油菜轉錄因子BnWRKY33抗菌核病功能研究.pdf

1、甘藍型油菜（Brassica napus）是我國重要的油料作物，而菌核病(Sclertiniasclerotiorum(Lib.) de Bary)是油菜生產最主要的限制因子，嚴重威脅著我國的油菜生產。目前，人們關于B.napus對S.sclerotiorum的抗病機制仍不甚了解。在對各種寄主和病原菌相互作用的研究中已經顯示，植物WRKY轉錄因子在寄主抗病性中起著重要作用，然而，對于WRKY轉錄因子在B.napus與S.scleroti

2、orum互作中的抗病機制仍沒有研究或未見報道。
　　本研究從B.napus中克隆了一個編碼WRKY轉錄因子的基因BnWRKY33，序列分析顯示，其編碼蛋白BnWRKY33含有兩個WRKY結構域和5個MAPK激酶磷酸化位點，且有一個在與VQ蛋白相互作用中起關鍵作用的天冬氨酸殘基。誘導表達實驗顯示，油菜被菌核病侵染后Bn WRKY33迅速上調表達，茉莉酸(JA)和水楊酸(SA)誘導時Bn WRK Y33也有不同程度地響應表達。結果表明

3、，Bn WRKY33是菌核病侵染的響應基因。
　　為了進一步研究Bn WRKY33的抗菌核病功能，本研究構建了BnWRKY33植物表達載體1300-35S-WRKY33-NOS，使用In planta Agrobacterium-mediated方法轉化油菜，并經潮霉素篩選和PCR檢測，鑒定獲得17個獨立的轉基因株系。本研究選擇了經RT-PCR表達分析鑒定出的3個獨立的Bn WRKY33過表達轉基因株系用作后續(xù)分析。
　　抗

4、病鑒定實驗顯示Bn WRKY33過表達油菜轉基因植株對菌核病的抗性顯著增強。qRT-PCR表達分析顯示，當BnWRKY33高表達時，茉莉酸防衛(wèi)反應標志基因BnPDF1.2和水楊酸防衛(wèi)反應標志基因BnPR1顯著上調表達;DAB組織染色實驗顯示，當S.sclerotiorum侵染時，Bn WRKY33的過量表達顯著抑制H2O2的積累。進而，我們從B.napus中分離了一個MAPK激酶底物基因BnMKS1，發(fā)現BnMKS1具有4個保守結構域和

5、10個MAPK激酶磷酸化位點，在第二個高度保守的結構域中，含有1個較短的FxxxVQxLTG VQ蛋白基序，表明BnMKS1屬于VQ蛋白家族。酵母雙雜交實驗證明，BnMKS1能夠與BnMPK4和BnWRKY33直接相互作用，而BnMPK4和BnWRKY33不能直接相互作用。在煙草葉片和油菜子葉中的瞬時表達實驗均顯示這三個蛋白都定位于細胞核。同時，誘導表達分析顯示它們對菌核病侵染表現為協同應答。
　　本研究表明，Bn WRKY33在