甘藍(lán)型油菜低溫誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄組和蛋白組分析.pdf

1、低溫限制著植物的生長(zhǎng)發(fā)育和地理分布，在全世界，每年因低溫傷害造成的農(nóng)作物損失高達(dá)數(shù)千億美元，因此，對(duì)植物抗寒調(diào)控機(jī)制和抗寒育種的研究有著極為迫切的現(xiàn)實(shí)需求。甘藍(lán)型油菜（Brassica napus L.）作為重要的油料作物在全球范圍內(nèi)廣泛種植，對(duì)低溫環(huán)境具有較強(qiáng)的耐受性，蘊(yùn)藏著豐富的抗寒基因。本研究以抗寒性較強(qiáng)的甘藍(lán)型冬油菜L9為實(shí)驗(yàn)材料，分別在4℃條件下取脅迫0h、2h、6h、12h和24 h五個(gè)點(diǎn)取樣，通過生理生化分析、切片觀察、轉(zhuǎn)

2、錄組測(cè)序分析和蛋白組測(cè)序分析，從RNA和蛋白質(zhì)水平研究甘藍(lán)型油菜葉片對(duì)低溫脅迫的響應(yīng)機(jī)制，結(jié)果總結(jié)如下:
　　1.甘藍(lán)型油菜響應(yīng)低溫脅迫的生理生化變化
　　在4℃低溫脅迫下，油菜葉片形態(tài)發(fā)生輕微變化，進(jìn)一步的生理生化研究發(fā)現(xiàn)，耐寒品系L9比敏感品系L7響應(yīng)低溫脅迫更迅速，耐寒性更強(qiáng)。脯氨酸含量、可溶性糖含量、L7葉片電導(dǎo)率、L9葉綠素a、b含量隨脅迫處理時(shí)間的延長(zhǎng)含量上升，而L9葉片電導(dǎo)率和L7葉綠素a、b含量隨脅迫處理時(shí)間

3、的延長(zhǎng)含量下降。透射電鏡觀察更進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，在低溫誘導(dǎo)下，葉綠體基粒片層結(jié)構(gòu)逐步彌散，線粒體數(shù)目顯著增加，這些細(xì)胞學(xué)指標(biāo)可以為抗寒性鑒定提供參考。
　　2.甘藍(lán)型油菜低溫誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄組分析
　　通過高通量測(cè)序及生物信息學(xué)分析，從4℃低溫脅迫0h、2h、6h、12h和24h下的甘藍(lán)型油菜葉片轉(zhuǎn)錄本中組裝出71280-90041個(gè)unigene，其中不同集群的有31789-38201個(gè)，不同singletons的有39491-518

4、40個(gè)，平均讀長(zhǎng)492bp，可歸類到25個(gè)COG分類中。比較不同的處理，發(fā)現(xiàn)低溫脅迫12h后有18641個(gè)（8499上調(diào)，10142個(gè)下調(diào)）基因表現(xiàn)差異，數(shù)量最多，其次是24 h（17824個(gè)）、6h（7901個(gè)）、2h（3198個(gè)）。差異基因聚類分析后得到13個(gè)類群，依據(jù)表達(dá)趨勢(shì)劃分為3大類。并且發(fā)現(xiàn)了大量和生物調(diào)控、免疫過程、代謝過程和應(yīng)激響應(yīng)等相關(guān)的差異功能基因，這些基因多數(shù)顯著富集在植物晝夜節(jié)律、植物-病原菌互作、植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)

5、導(dǎo)及次生代謝物生物合成等通路中。
　　3.AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子響應(yīng)低溫脅迫的動(dòng)態(tài)調(diào)控
　　對(duì)甘藍(lán)型油菜4℃低溫脅迫2h、6h、12h及24 h下的全基因組轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行比對(duì)分析，鑒定出132個(gè)AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子，經(jīng)聚類分析結(jié)果表明，這些轉(zhuǎn)錄因子可聚為4個(gè)亞族13個(gè)亞組，其中DREB亞族和ERF亞族聚有114個(gè)基因，未發(fā)現(xiàn)有基因聚到Soloist亞族和DREB A3亞組。經(jīng)染色體定位分析，有118個(gè)基因非均勻地分布在A1-C

6、9染色體上，其中A9和C7分布最多，A5和C4分布最少。GO功能分析發(fā)現(xiàn)這些基因參與增強(qiáng)植物抗寒性的多種分子功能途徑中，在不同低溫脅迫階段，AP2/ERF亞族之間表現(xiàn)一種動(dòng)態(tài)調(diào)控，RAV亞族和DREB亞族響應(yīng)低溫脅迫比較迅速，AP2亞族后期才逐漸對(duì)低溫脅迫進(jìn)行響應(yīng);ERF亞族和DREB亞族是參與低溫調(diào)控的兩個(gè)主要亞族，RAV亞族通過正調(diào)控在植物抗寒過程中發(fā)揮作用。將4個(gè)脅迫階段均出現(xiàn)差異表達(dá)的13個(gè)AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行定量PCR驗(yàn)

7、證，表明差異表達(dá)趨勢(shì)與轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)結(jié)果一致。
　　4.甘藍(lán)型油菜低溫誘導(dǎo)的蛋白組分析
　　通過iTRAQ測(cè)序分析，從4℃低溫脅迫0h、2h、6h、12h和24 h下的甘藍(lán)型油菜葉片肽段圖譜中，鑒定到3148個(gè)蛋白質(zhì)，肽鏈長(zhǎng)度主要分布在8-13 aa之間。經(jīng)過GO功能注釋和通路分析，鑒定到的蛋白質(zhì)被注釋到53條GO條目和123條通路中。兩兩比較不同處理發(fā)現(xiàn)，在低溫脅迫24 h的情況下差異蛋白質(zhì)最多，在572個(gè)蛋白質(zhì)中有320個(gè)表

8、現(xiàn)上調(diào)，252個(gè)表現(xiàn)下調(diào)。通路富集分析表明，低溫脅迫2h后，顯著富集的通路包括光合天線蛋白和類胡蘿卜素生物合成途徑;6 h后顯著富集在賴氨酸、光合天線蛋白、氨基丙酸和組氨酸等4個(gè)途徑中;在12h后顯著富集在光合天線蛋白、光合作用、吞噬體和乙醛酸鹽-羧酸鹽新陳代謝等4個(gè)途徑中;在24h后則顯著富集在光合天線蛋白、甘油磷脂新陳代謝和植物-病原菌互作3個(gè)途徑中。
　　5.低溫誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄組和蛋白組關(guān)聯(lián)分析
　　將本實(shí)驗(yàn)中的轉(zhuǎn)錄組和蛋

9、白組差異表達(dá)基因進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析發(fā)現(xiàn)，低溫脅迫的所有階段中，具有相同趨勢(shì)的可關(guān)聯(lián)差異基因有177個(gè)，可注釋在40條GO條目中，并在不同的階段，表現(xiàn)一種動(dòng)態(tài)變化。在分子功能中，主要為催化活性和結(jié)合通路;在生物過程中，主要為代謝過程和細(xì)胞生理過程，在刺激應(yīng)答通路也注釋了較多的關(guān)聯(lián)基因。這些具有相同趨勢(shì)的關(guān)聯(lián)差異基因在次生物質(zhì)代謝、激素信號(hào)通路、植物-病原菌互作等通路明顯富集。對(duì)低溫誘導(dǎo)的甘藍(lán)型油菜葉片轉(zhuǎn)錄組和蛋白組表達(dá)趨勢(shì)相反的差異基因進(jìn)行GO