甘藍(lán)型油菜SOD基因的克隆及菌核病菌誘導(dǎo)的表達(dá).pdf

1、超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，簡(jiǎn)稱SOD）是一種金屬酶類，它可分為四類，分別是Cu／Zn-SOD，Mn-SOD，F(xiàn)e-SOD和Ni-SOD。SOD是一種重要的氧自由基清除劑，能催化超氧陰離子（O2<,2><`>）的歧化反應(yīng)。 本文根據(jù)GenBank中所登錄的各種植物銅鋅型超氧化物歧化酶（Cu／Zn-SOD）與鐵型超氧化物歧化酶（Fe-SOD）基因的氨基酸序列及核苷酸序列，設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物，RT-PCR擴(kuò)增

2、甘藍(lán)型油菜（Brassica napus）兩種SOD基因中間片段。利用RACE-PCR的方法得到Cu／Zn-SOD基因的3’末端和5’末端及Fe-SOD基因的3’末端。序列拼接獲得兩種SOD（Cu／ZnSOD和Fe-SOD）基因的cDNA。將推測(cè)的氨基酸序列在GenBank中進(jìn)行序列同源性比較發(fā)現(xiàn)，甘藍(lán)型油菜Cu／Zn-SOD與大白菜（Brassica rapa ssp.pekinensis）的細(xì)胞質(zhì)Cu／Zn-SOD氨基酸序列同源性達(dá)

3、99％；而Fe-SOD與擬南芥（Arabidopsis thaliana）Fe-SOD3的同源性達(dá)97％。 生物信息學(xué)分析Cu／Zn-SOD基因ORF框長(zhǎng)459bp，編碼152aa的蛋白。該蛋白分子量為15.179KD，等電點(diǎn)5.65，為一個(gè)酸性蛋白。二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)該蛋白富含延伸鏈和隨機(jī)卷曲結(jié)構(gòu)，而且該蛋白還具有極高的親水性。另外，該蛋白含有兩個(gè)Cu／Zn-SOD信號(hào)1和2位點(diǎn)、一個(gè)N端糖基化位點(diǎn)、五個(gè)不同的N端酰基化位點(diǎn)和一

4、個(gè)酪蛋白激酶II磷酸化位點(diǎn)。 生物信息學(xué)分析Fe-SOD基因ORF框長(zhǎng)492bp，編碼163aa的蛋白。該蛋白分子量為18.899KD，等電點(diǎn)5.07，為一個(gè)酸性蛋白。二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)該蛋白富含a-螺旋和隨機(jī)卷曲結(jié)構(gòu)，該蛋白也具有極高的親水性。另外，該蛋白含有一個(gè)Mn和Fe的SOD信號(hào)位點(diǎn)和一個(gè)N端?；稽c(diǎn)。 以中油821基因組為模板，根據(jù)全長(zhǎng)Cu／Zn-SOD的cDNA序列設(shè)計(jì)一對(duì)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到Cu／Zn-

5、SOD基因組DNA。甘藍(lán)型油菜Cu／Zn-SOD基因組DNA序列長(zhǎng)為1322bp，登陸GenBank，序列號(hào)為DQ431853。Cu／Zn-SOD基因在基因組序列結(jié)構(gòu)上具有7個(gè)外顯子和6個(gè)內(nèi)含子。 SOD酶活測(cè)定結(jié)果表明：菌核病菌誘導(dǎo)前，抗（耐）菌核病品種的SOD活性顯著或極顯著大于感病品種的SOD酶活，其中抗（耐）菌核病品種SOD活性平均比感病品種高74.63％；菌核病菌誘導(dǎo)后，各品種SOD活性比菌核病菌誘導(dǎo)前都有所升高，其中

6、感病品種平均上升幅度為66.04％，極顯著大于抗（耐）病品種活性上升幅度。接菌葉中，寧RS-1和中R888兩個(gè)品種的SOD活性極顯著大于其它幾個(gè)品種，而中油821與感病品種植株葉片SOD活性無(wú)明顯差異。 利用擴(kuò)增的487bpCu／Zn-SOD的cDNA片段作探針，對(duì)菌核病菌誘導(dǎo)前后的不同抗（耐）、感菌核病品種mRNA進(jìn)行Northern blotting，Northern雜交的結(jié)果表明該基因片斷菌核病菌誘導(dǎo)前后在甘藍(lán)型油菜抗（耐