五個雙芐基異喹啉生物堿與BCRP的相互作用以及CYP3A5對其代謝激活作用.pdf

1、雙芐基異喹啉類生物堿是一類結構中含有兩個芐基基團以及四氫異喹啉基團的生物堿，許多含有這類生物堿的植物在中國以及其他國家地區(qū)都是用來治療疾病的傳統(tǒng)藥材。本文選擇了5個結構類似并具有多種藥理活性的雙芐基異喹啉生物堿，分別是蓮心堿、甲基蓮心堿、異蓮心堿、蝙蝠葛堿和漢防已堿作為研究對象，一方面應用建立的高表達乳腺癌耐藥蛋白(breast cancer resisitance protein，BCRP)的LLC-PK1/BCRP細胞模型，研究這些

2、生物堿與BCRP的相互作用，探究BCRP對它們的體內(nèi)處置過程及藥理活性的潛在影響;另一方面應用建立的WI-38/3A5細胞模型，研究CYP3A5對這些生物堿的代謝激活作用和在肺毒性中所起的作用，闡明這類生物堿產(chǎn)生肺毒性的機理。
　　1.LLC-PK1/BCRP細胞模型的建立及其生物學特征
　　為建立高表達BCRP的細胞模型，應用脂質體轉染的方法將質粒pcDNA3.1(+)-BCRP轉入LLC-PK1細胞。細胞經(jīng)G418篩選后

3、，采用細胞群體倍增試驗、流式細胞術和Western blot等方法鑒定;以體外細胞毒試驗，檢測轉基因細胞模型對米托葸醌和阿霉素的耐藥指數(shù);用熒光倒置顯微鏡，檢測其對熒光染料Hoechst33342的外排作用;并以GF120918為BCRP抑制劑，觀察抑制劑對BCRP外排熒光染料的逆轉作用。結果表明，LLC-PK1/BCRP細胞高表達BCRP蛋白;細胞群體倍增時間較親本細胞略有延長;對米托蒽醌和阿霉素的耐藥指數(shù)分別增加至51.92倍和6.

4、09倍;對熒光染料Hoechst33342的外排作用明顯增強，且可被抑制劑GF120918逆轉。因此高表達BCRP的豬腎小管上皮細胞-LLC-PK1/BCRP細胞構建成功，可作為進一步研究BCRP與藥物相互作用的模型。
　　2.五個雙芐基異喹啉類生物堿與BCRP的相互作用
　　本研究應用構建的LLC-PK1/BCRP細胞模型研究BCRP與5個生物堿的相互作用特性。體外研究結果可以提示BCRP在生物堿的體內(nèi)處置過程中和藥理活性

5、的發(fā)揮中的潛在影響。我們通過MTT試驗測定了5個生物堿對LLC-PK1和LLC-PK1/BCRP細胞的毒性，為后續(xù)實驗的濃度設計提供依據(jù);進行細胞積聚實驗和雙向轉運實驗來檢驗這5個生物堿是否為BCRP的底物。實驗結果表明，這5個生物堿透過生物膜的能力并不強，除甲基蓮心堿在最高濃度下(30μmol/L)的Papp值在5×10-6cm/s左右外，其余幾個生物堿的Papp值均小于3.5×10-6cm/s。蓮心堿是BCRP的底物，在雙向轉運實驗

6、中，低濃度下(10μmol/L)，它的凈外排比為2.87;但是隨著給藥濃度的升高，蓮心堿的凈外排比有所下降，提示BCRP對蓮心堿的轉運存在飽和現(xiàn)象;細胞積聚實驗也顯示蓮心堿在LLC-PK1/BCRP細胞內(nèi)的積聚量顯著少于LLC-PK1細胞。蝙蝠葛堿是BCRP的弱底物，雙向轉運實驗的凈外排比在1.6左右，并且在LLC-PK1/BCRP細胞內(nèi)的積聚量略少于LLC-PK1細胞。而異蓮心堿、甲基蓮心堿和漢防己堿均不是BCRP的底物。為在蛋白分子

7、水平上揭示BCRP與這5個生物堿的相互作用情況，找出參與相互作用的氨基酸殘基，進行了分子對接計算。計算結果顯示，蓮心堿與482位精氨酸殘基和490位蘇氨酸殘基可各形成一條氫鍵;蝙蝠葛堿與BCRP有疏水相互作用。由此可知，BCRP可外排蓮心堿和蝙蝠葛堿，對它們的藥理活性和體內(nèi)處置過程可能存在影響。
　　3.CYP3A5在五個雙芐基異喹啉類生物堿的代謝激活中的作用
　　前期在動物上進行的組織分布研究表明，這5個生物堿在肺內(nèi)的分布

8、濃度均較高;蝙蝠葛堿和漢防己堿大劑量腹腔注射給藥時可產(chǎn)生嚴重的肺毒性?？赡苁怯捎谇捌谶M行的關于甲基蓮心堿、異蓮心堿和蓮心堿的研究給藥劑量均較低，它們的肺毒性還未見報道。文獻推測蝙蝠葛堿與漢防己堿的肺毒性與CYP3A酶介導的代謝激活相關，由于在肺內(nèi)表達的CYP3A亞族的酶為CYP3A5，因此，為研究CYP3A5在蝙蝠葛堿等的肺毒性中所起的作用，建立了WI-38/3A5細胞模型。通過MTT、MTS和LDH試驗，發(fā)現(xiàn)5個生物堿在WI-38/3

9、A5細胞上的毒性均強于WI-38/Vector細胞，其中漢防己堿的毒性最強。通過檢測細胞內(nèi)ROS水平、GSH水平和細胞凋亡情況，發(fā)現(xiàn)CYP3A5在細胞內(nèi)表達水平的升高，使?jié)h防己堿對細胞的毒性增強。實驗結果顯示，轉染CYP3A5基因的WI-38細胞加入漢防已堿處理后，細胞存活率更低，胞內(nèi)ROS水平更高，GSH水平更低，細胞凋亡的情況更嚴重。這說明，CYP3A5參與了漢防己堿的代謝激活，是漢防已堿引起肺毒性的原因之一。由于蓮心堿、異蓮心堿和