丁酸鈉誘導(dǎo)Eca-109細(xì)胞凋亡的研究.pdf

1、組蛋白(Hi．one)是將。DNA組裝和包裹形成核小體的小分子堿性蛋白。核組蛋白的乙酰化作用和去乙?；饔门c基因的轉(zhuǎn)錄有關(guān)，且在調(diào)節(jié)基因表達(dá)和染色質(zhì)凝集方面具有重要作用，因此，提出一種可通過(guò)抑制去乙?；傅淖饔眠M(jìn)而治療人類(lèi)腫瘤的新的治療方式。近些年，大量研究資料顯示，去乙?；敢种苿┩ㄟ^(guò)調(diào)節(jié)大多數(shù)基因表達(dá)發(fā)揮其不同的抗癌作用，并且目前已被應(yīng)用于多種臨床試驗(yàn)研究中檢測(cè)它的效用。丁酸鈉(sodium butyrate,SB)是膳食纖維在腸道

2、中酵解后產(chǎn)生的一種無(wú)毒的短鏈脂肪酸，是人體最基本的生理性去乙?；敢种埔蜃?，對(duì)預(yù)防結(jié)直腸癌的發(fā)生有重要的保護(hù)作用。早期研究證實(shí)丁酸鈉具有抑制細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)細(xì)胞分化以及促進(jìn)體外多種腫瘤細(xì)胞凋亡的作用。然而，丁酸鈉誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡以及下游受體參與凋亡發(fā)生的機(jī)制目前還不清楚。 大量研究表明細(xì)胞接受凋亡信號(hào)刺激后，至少經(jīng)過(guò)兩條特征性的凋亡途徑即Caspase(Cysteinyl aspartate-specific proteinases)

3、依賴(lài)和非依賴(lài)途徑。其中一種是凋亡發(fā)生的主要途徑，即通過(guò)結(jié)合Fas受體由此激活Caspase-8啟動(dòng)凋亡的Caspase依賴(lài)途徑。有活性的Caspase-8同時(shí)也激活Bcl-2家族的促凋亡因子，如Bax能觸發(fā)一系列的凋亡事件發(fā)生，導(dǎo)致線(xiàn)粒體膜的通透性增加、線(xiàn)粒體腫脹、線(xiàn)粒體內(nèi)膜的跨膜電位(△ψm)下降，以致線(xiàn)粒體中細(xì)胞色素C和Smac/Diablo釋放入胞漿，細(xì)胞色素C與Apaf-1結(jié)合Caspase-9形成凋亡體(apoptosome)

4、，并在dATP輔助下，激活Caspase-9。Caspase-9再酶解Caspase-3前體，釋放出C末端小肽片段，從而活化Caspase-3，并參與到級(jí)聯(lián)反應(yīng)中，裂解個(gè)別的酶作用底物如PARP，引起線(xiàn)粒體DNA斷裂和形態(tài)學(xué)改變等細(xì)胞凋亡特征。與此同時(shí)，Smac/Diablo結(jié)合上Caspase-3抑制物，增加Caspase-3活性。CaspaLse不是唯一引起細(xì)胞凋亡的影響因子，一些其他的線(xiàn)粒體前凋亡蛋白如AIF是以Caspase非依

5、賴(lài)方式調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡同時(shí)從線(xiàn)粒體內(nèi)膜間隙被釋放出來(lái)。AIF以caspaSe非依賴(lài)的方式位移到細(xì)胞核并參與染色質(zhì)初期的凝集和大多數(shù)DNA斷裂。近年來(lái)，丁酸鈉誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡中與Caspase所起的相關(guān)作用報(bào)道很多，例如，丁酸鈉通過(guò)改變蛋白活性加強(qiáng)肝癌細(xì)胞對(duì)Fas信號(hào)途徑Caspase的敏感性；丁酸鈉誘導(dǎo)的肺癌，前列腺癌和宮頸癌細(xì)胞凋亡需要激活的Caspase-3的參與；丁酸鈉治療白血病和成神經(jīng)管細(xì)胞瘤與凋亡中的Caspase-8有關(guān)：在結(jié)直腸腫

6、瘤細(xì)胞中丁酸鈉誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡關(guān)鍵是有細(xì)胞色素C釋放及Casper9的參與等。到目前為止，AIF等細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)因子在凋亡過(guò)程中所起的作用，特別是在丁酸鈉誘導(dǎo)的食管癌細(xì)胞株Eca-109細(xì)胞凋亡是否有AIF參與還沒(méi)有相關(guān)報(bào)道。 本試驗(yàn)利用MTT比色法和DNA瓊脂糖電泳檢測(cè)Eca-109細(xì)胞凋亡的發(fā)生；利用Western blotting技術(shù)，通過(guò)研究細(xì)胞色素C從線(xiàn)粒體轉(zhuǎn)移到胞漿，AIF從線(xiàn)粒體內(nèi)膜的釋放等凋亡發(fā)生事件以及與Casp

7、ase的關(guān)系，來(lái)進(jìn)一步闡明丁酸鈉誘導(dǎo)食管癌細(xì)胞株Eca-109細(xì)胞凋亡發(fā)生的機(jī)制。 方法 1.MTT法測(cè)定丁酸鈉對(duì)Eca-109細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率。試驗(yàn)分三組：①試驗(yàn)組：分別加入lmmol/L、2.5mmol/L、5mmol/L三種不同濃度的丁酸鈉；②陰性對(duì)照組：不加藥物；③空白對(duì)照組：加入等體積的生理鹽水。每個(gè)濃度設(shè)四個(gè)平行孔，分別作用Eca-109細(xì)胞24h、48h、72h后測(cè)定細(xì)胞在570nm波長(zhǎng)吸光度值，計(jì)算細(xì)胞生

8、長(zhǎng)抑制率，以上試驗(yàn)重復(fù)3次，求平均值。 2.用DNA瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)細(xì)胞凋亡；用western blotting技術(shù)檢測(cè)2.5mmoFL，丁酸鈉處理Eca-109細(xì)胞后，Caspase-8的活性在不同作用時(shí)間的表達(dá)情況以及檢測(cè)在丁酸鈉處理前后線(xiàn)粒體和胞漿中細(xì)胞色素C及凋亡相關(guān)蛋白AIF蛋白表達(dá)的變化，并用圖文分析系統(tǒng)進(jìn)行分析。 結(jié)果 1-丁酸鈉對(duì)Eca-109細(xì)胞的增殖抑制作用丁酸鈉對(duì)Eca-109細(xì)胞生長(zhǎng)有明

9、顯的的抑制作用。丁酸鈉濃度為1mmol/L、2.5mmol/L、5 mmol/L處理Eca-109細(xì)胞，分別測(cè)定各濃度組在24h、48h、72h后細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率。處理24h后各濃度組細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率分別為13．38﹪、33．40﹪、39．04﹪：處理48h后各濃度組細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率分別為14．06﹪、34．25﹪、46．50﹪；處理72h后各濃度組細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率分別為32．10﹪、40．65﹪、48．23﹪。細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率隨藥物濃度增加、作

10、用時(shí)間延長(zhǎng)而升高，具有明顯的時(shí)間—?jiǎng)┝恳蕾?lài)性。與1mmol/L組比較：2．5 mmol/L和5 mmol/L濃度組在24h、48h、72h的各個(gè)時(shí)間段比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與2．5mmol/L組比較：5 mmol/L濃度組在24h、72h時(shí)間段有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，5 mmol/L濃度組在48h有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。與24h比較：在48h時(shí)5 mmol/L濃度組有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，72h時(shí)各濃度組

11、均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與48h比較：2．5 mmol/L濃度組在72h有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，1mmol/L濃度組在72h有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性差異(P<0.01)。 2．丁酸鈉誘導(dǎo)Eca-109細(xì)胞凋亡的作用2．1丁酸鈉2．5mmol/L作用于Eca-109細(xì)胞48h、72h后，DNA瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，加藥組有明顯的DNA梯形凋亡條帶，未加藥組無(wú)明顯的DNA梯形凋亡條帶出現(xiàn)。 2．2 Western blotti

12、ng技術(shù)檢測(cè)2．5mmol/L丁酸鈉處理Eca-109細(xì)胞在Oh、12h、24h、48h、72h后的Caspase-8的活性，發(fā)現(xiàn)從12h開(kāi)始出現(xiàn)caspases-8的活性單位，到48h達(dá)到高峰，72h與48h的caspases-8活性單位沒(méi)有明顯差別。結(jié)果顯示caspases-8活性單位隨著丁酸鈉處理時(shí)間延長(zhǎng)表達(dá)增強(qiáng)，具有一定時(shí)間依賴(lài)性。結(jié)果表明丁酸鈉誘導(dǎo)Eca-109細(xì)胞凋亡可能依賴(lài)caspases凋亡途徑進(jìn)行。 2．3 W

13、estern blotting技術(shù)檢測(cè)Eca-109細(xì)胞中有細(xì)胞色素C及AIF蛋白分布。2．5mmol/L丁酸鈉細(xì)胞處理48h后二者在線(xiàn)粒體中表達(dá)明顯降低，而在胞漿中表達(dá)增強(qiáng)。 結(jié)論 1．丁酸鈉對(duì)Eca-109細(xì)胞有顯著的抗增殖作用，其抗增殖作用呈明顯的劑量—時(shí)間依賴(lài)關(guān)系。 2．丁酸鈉抗Eca-109細(xì)胞增殖是通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡而進(jìn)行，可能是以Caspase依賴(lài)及非依賴(lài)兩種方式進(jìn)行。 3．丁酸鈉誘導(dǎo)Eca-