丹皮酚體內(nèi)外誘導(dǎo)人食管癌Eca-109細(xì)胞凋亡及其機(jī)制研究.pdf

1、食管癌(esophageal cancer，EC)是最常見的惡性腫瘤之一，世界范圍內(nèi)因癌癥死亡的病例中，食管癌居第6位。世界上食管癌每年新發(fā)病例約為30萬人，其中大約一半在中國。食管癌有腺癌(adenocarcinoma,AC)和鱗癌(squamous cellcarcinoma,SCC)兩種病理類型，中國以鱗癌多見。雖然EC的手術(shù)方法和治療有顯著的進(jìn)步，但EC的預(yù)后很差。因此，探求新的有價(jià)值治療手段和策略顯得十分必要。從中藥和其他天然

2、產(chǎn)物中尋求高效、低毒的新型抗食管癌物質(zhì)并深入探討其抗腫瘤作用機(jī)制是當(dāng)前國內(nèi)外研究的重要課題。 越來越多的研究表明，腫瘤與炎癥密切相關(guān)。在那些炎癥相關(guān)的腫瘤中，COX-2表達(dá)普遍上調(diào)。慢性炎癥是導(dǎo)致食管癌發(fā)生的一個(gè)重要原因，COX-2可能在其中發(fā)揮了很重要的作用。選擇性COX-2抑制劑預(yù)防腫瘤的作用已經(jīng)引起學(xué)者們的關(guān)注，針對(duì)COX-2的抗食管癌治療是目前研究的熱點(diǎn)。 Survivin是一種獨(dú)特的凋亡抑制基因，屬于凋亡蛋白抑

3、制因子(inhbitotapoptosis proteins，IAPs)家族。在食管癌、結(jié)直腸癌、膀胱癌、非小細(xì)胞肺癌和乳腺癌中呈過表達(dá)。近期研究發(fā)現(xiàn)，Survivin的表達(dá)與食管癌對(duì)放化療的敏感性和預(yù)后有密切的聯(lián)系。 丹皮酚(Paeonol，Pae)又稱牡丹酚，是毛莨科植物牡丹Paeonia Suffruicosa Andr.根皮和蘿摩科植物徐長卿Pycnostelma Paniculatum(Bunge)K.Schum干燥根

4、或全草的主要有效成分。現(xiàn)代藥理研究表明，Pae具有鎮(zhèn)靜催眠、解熱鎮(zhèn)痛、抗菌消炎、免疫調(diào)節(jié)、抗氧化及保護(hù)心腦血管等廣泛的藥理活性。我們?cè)谇捌诎l(fā)現(xiàn)，Pae在體內(nèi)外具有明顯的抗腫瘤作用，本研究通過觀察Pae在體內(nèi)外對(duì)人Eca-109食管癌細(xì)胞COX-2、Survivin表達(dá)的影響，進(jìn)一步探討其作用機(jī)制。 1.Pae體內(nèi)外對(duì)Eca-109細(xì)胞增殖的影響 1.1 Pae體外對(duì)Eca-109細(xì)胞增殖的影響。選用人食管鱗癌細(xì)胞株Eca

5、-109，采用MTT法檢測(cè)了Pae體外抑制人食管癌細(xì)胞株增殖的量效和時(shí)效關(guān)系。結(jié)果顯示：(1)Pae(7.81～250 mg·L-1)對(duì)細(xì)胞有增殖抑制作用，藥物濃度越高，抑制作用越強(qiáng)，呈現(xiàn)明顯的劑量效應(yīng)關(guān)系。以濃度的對(duì)數(shù)與抑制率進(jìn)行直線相關(guān)分析：r=0.908，P<0.05。IC50值為98.68mg·L-1。(2)系列濃度Pae作用于細(xì)胞24h、48h及72h后觀察細(xì)胞的生長情況，結(jié)果顯示Pae作用時(shí)間越長，對(duì)上述細(xì)胞的抑制作用越強(qiáng)，

6、呈時(shí)間依賴性。 1.2 Pae體內(nèi)對(duì)Eca-109細(xì)胞增殖的影響。Pae 50,100和200 mg·kg-1組和CDDP 5 mg·kg-1組均能明顯抑制裸鼠皮下腫瘤的生長，抑瘤率分別為23.54％，27.91％，34.46％和58.71％，一定劑量的Pae具有抑制人Eca-109食管癌裸鼠移植瘤生長的作用，且抑瘤率隨著藥物劑量的增加逐漸升高。以濃度的對(duì)數(shù)與抑制率進(jìn)行直線相關(guān)分析，r=0.974，P<0.05。 2.P

7、ae體內(nèi)外誘導(dǎo)Eca-109細(xì)胞凋亡 2.1 Pae體外誘導(dǎo)Eca-109細(xì)胞凋亡選用末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的缺口末端標(biāo)記(TUNEL)法，檢測(cè)細(xì)胞凋亡。采用凋亡指數(shù)分析凋亡細(xì)胞百分比，Pae作用24h后，可檢測(cè)到形態(tài)發(fā)生改變的早期凋亡細(xì)胞。24h、48h和72h時(shí)其凋亡發(fā)生率分別為(5.2±0.9)％、(14.7±1.8)％和(18.3±2.4)％與對(duì)照組(1.8±1.5)％比較，差異具有顯著性(P<0.01)。應(yīng)用流式細(xì)胞

8、儀(Flow Cytometry,FCM)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。Pae可誘導(dǎo)Eca-109食管癌細(xì)胞發(fā)生凋亡，在DNA直方圖上G0/Gl期前可見亞GI峰即凋亡峰，24h、48h和72h時(shí)其凋亡發(fā)生率分別為4.3％、13.1％及17.6％。其誘導(dǎo)凋亡作用呈現(xiàn)明顯時(shí)間依賴關(guān)系。 2.2 Pae體內(nèi)誘導(dǎo)Eca-109細(xì)胞凋亡TUNEL染色可發(fā)現(xiàn)棕褐色的凋亡細(xì)胞呈散在或片狀分布，Pae各劑量組的調(diào)亡指數(shù)(apoptosisindex，AI)分

9、別為(11.02±2.58)％、(19.80±2.77)％、(24.48±4.35)％和(27.13±4.39)％，與模型組(4.81±0.83)％比較，差異均有顯著性意義(P<0.05orP<0.01)。 3.Pae作用后Eca-109細(xì)胞周期變化 應(yīng)用Mcycle軟件分析Pae作用后細(xì)胞周期的變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Pae作用后可引起細(xì)胞周期的變化。Pae可引起人Eca-109食管癌細(xì)胞S期細(xì)胞大量堆積，G0/G1期細(xì)胞比例

10、明顯下降，細(xì)胞被阻滯在S期。 4.Pae體內(nèi)外對(duì)Eca-109細(xì)胞COX-2和SurviVin表達(dá)影響 采用免疫組化S-P法分別檢測(cè)人Eca-109食管癌細(xì)胞和裸鼠抑制瘤COX-2和Survivin的表達(dá)。運(yùn)用生物圖像分析系統(tǒng)軟件分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Pae體內(nèi)外均能下調(diào)COX-2和Survivin的表達(dá)。 5.結(jié)論： Pae在體外能抑制人食管癌Eca-109細(xì)胞增殖、體內(nèi)有抗裸鼠移植瘤作用，其機(jī)制可能與下調(diào)C