熊果酸體內(nèi)外抗人食管癌Eca-109細(xì)胞的作用與機(jī)制.pdf

1、目的：熊果酸（Ursolic acid，UA）是從天然藥用植物中提取的五環(huán)三萜類化合物，近年來(lái)研究表明其具有顯著的抗腫瘤活性，但具體機(jī)制仍不明確；有關(guān)于UA抗人食管的報(bào)道較少。本實(shí)驗(yàn)擬研究UA對(duì)體外培養(yǎng)的人食管癌細(xì)胞Eca-109的誘導(dǎo)凋亡、抑制增殖作用及其可能的機(jī)制，并建立人食管癌裸鼠移植瘤動(dòng)物模型，進(jìn)一步探討UA在體內(nèi)對(duì)Eca-109細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用與機(jī)制。 方法：1.UA體外作用于Eca-109細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)研究：①M(fèi)TT法

2、檢測(cè)不同濃度UA（0、10、20、30、40、50μmol/L）作用于Eca-109細(xì)胞24、48、72h后的增殖抑制作用，并分別計(jì)算IC50。②透射電鏡觀察經(jīng)0、18.32（1/2 IC50）、36.65μmol/L（IC50）UA作用48h后細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的改變。③Hoechst33258熒光染色觀察不同濃度UA（0～50μmol/L）作用48h后Eca-109細(xì)胞的凋亡形態(tài)變化。④流式細(xì)胞術(shù)分析經(jīng)0～50μmol/L UA處理48h

3、后細(xì)胞周期分布與凋亡率。⑤Western blot分析不同濃度UA（0～50μmol/L）作用48h后對(duì)Eca-109細(xì)胞P27kip1、Bax、Bcl-2等蛋白表達(dá)的影響。 2.UA作用于人食管癌裸鼠移植瘤的實(shí)驗(yàn)研究：①建立12只人食管癌Eca-109細(xì)胞裸鼠移植瘤動(dòng)物模型，成瘤后隨機(jī)分為四組，每組三只。分別給予0.2ml生理鹽水、25、50、100mg/Kg/d UA腹腔隔天注射治療，治療14天后處死裸鼠，稱瘤重、計(jì)算抑瘤率

4、。②HE染色觀察各組腫瘤組織與裸鼠重要器官（肝、腎、心、肺、脾等。）組織形態(tài)學(xué)變化。③透射電鏡觀察各組腫瘤組織超微結(jié)構(gòu)的改變。④TUNEL法檢測(cè)各濃度UA對(duì)腫瘤組織凋亡指數(shù)的影響。⑤免疫組化染色分析各組腫瘤組織COX-2、Bax、Bcl-2等蛋白表達(dá)的變化。 結(jié)果：1.體外實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果：①20～50μmol/L UA對(duì)Eca-109細(xì)胞具有顯著的增殖抑制作用（P<0.01），并具明顯的量效、時(shí)效依賴性，作用24、48、72h后的

5、IC50分別為41.57，36.65，32.81μmol/L。②18.32～36.65μmol/L UA處理48h后的Eca-109細(xì)胞在電鏡下見(jiàn)典型的凋亡小體形成。③UA作用后Hoechst33258染色見(jiàn)Eca-109細(xì)胞核固縮變小、熒光亮度增強(qiáng)。④流式細(xì)胞分析結(jié)果顯示UA將Eca-109細(xì)胞阻滯在G0/G1期，增殖指數(shù)隨著UA上升而下降，而凋亡率隨之增加。⑤Western blot結(jié)果提示UA下調(diào)Eca-109細(xì)胞Bcl-2表達(dá)，

6、上調(diào)Bax、P27kip1表達(dá)。 2.體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果：①UA能抑制移植瘤生長(zhǎng)，經(jīng)25、50、100mg/Kg/d UA作用后的抑瘤率分別為19.85％、49.60％、71.16％。②HE染色結(jié)果提示UA處理后的腫瘤組織細(xì)胞間質(zhì)增多，細(xì)胞密度下降，核分裂相減少，部份細(xì)胞出現(xiàn)核固縮、碎裂等凋亡形態(tài)改變，裸鼠重要器官未發(fā)現(xiàn)明顯病理變化。③電鏡下觀察到實(shí)驗(yàn)組腫瘤組織凋亡形態(tài)學(xué)改變。④TUNEL法檢測(cè)各組凋亡指數(shù)分別為1.70％±1.0

7、5，3.53％±0.60，13.47％±1.07，29.60％±2.89。⑤免疫組化染色提示UA上調(diào)腫瘤組織Bax表達(dá)，下調(diào)COX-2、Bcl-2表達(dá)。 結(jié)論：UA能誘導(dǎo)體外培養(yǎng)的Eca-109細(xì)胞凋亡、抑制細(xì)胞增殖，其作用與下調(diào)Bcl-2、上調(diào)Bax的表達(dá)，提高P27kip1表達(dá)將細(xì)胞阻滯在G0/G1期有關(guān)；同時(shí)UA能抑制人食管癌裸鼠移植瘤生長(zhǎng)，下調(diào)Bcl-2、上調(diào)Bax的表達(dá)誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡、抑制COX-2表達(dá)可能是其作用機(jī)