甜菜夜蛾蛹黑突變體的適合度變化及其黑化機(jī)制研究.pdf

1、甜菜夜蛾Spodoptera exigua(Hübner)（鱗翅目:夜蛾科）是一種重要的世界性分布的多食性農(nóng)業(yè)害蟲。甜菜夜蛾蛹黑突變體(Spodoptera exigua melanie mutant，SEM)是2003年自湖北省荊州市棉田中采集的正常型甜菜夜蛾(Spodoptera exiguawild-type，SEW)經(jīng)室內(nèi)用人工飼料飼養(yǎng)至6代出現(xiàn)，其表型為蛹黑色，至今12年，蛹黑色性狀穩(wěn)定，未發(fā)生任何分離變化或回復(fù)突變，成為甜菜

2、夜蛾的一個(gè)穩(wěn)定的蛹黑突變品系(SEM)。本研究對(duì)SEM的形態(tài)進(jìn)行連續(xù)觀察，對(duì)適合度變化進(jìn)行了系統(tǒng)比較研究，研究了黑色素合成相關(guān)基因在SEM品系和SEW品系之間的差異表達(dá)及其轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制，為深入認(rèn)識(shí)蛹黑突變形成機(jī)制，進(jìn)一步解釋蛹黑突變與相關(guān)生物學(xué)性狀改變之間的聯(lián)系提供理論依據(jù)，為全面了解SEM品系產(chǎn)生的機(jī)制提供理論基礎(chǔ)。取得以下研究結(jié)果:
　　1甜菜夜蛾蛹黑突變品系較正常品系的適合度明顯提高
　　甜菜夜蛾SEM品系在蛹期表現(xiàn)出

3、整體黑化，在卵期、幼蟲期、成蟲期與SEW品系無(wú)顯著差異;SEM品系化蛹后6h完成蛹表皮的黑化過程;SEM品系的世代發(fā)育速度比SEW品系顯著加快，相比SEW品系蛹重增加13.16％、交配率提高25.60％、交配次數(shù)增多66.67％、產(chǎn)卵量提高148.19％，有更高的凈生殖率（R0=275.66）和種群增長(zhǎng)指數(shù)（I=123.73）;SEW和SEM品系之間交配次數(shù)最高的是兩品系雜交組合（♀SEW×♂ SEM為2.40±1.30次;♀SEM×♂

4、 SEW為2.43±1.22次），其次是SEM品系自交（1.97±1.01次），最低的是SEW自交(1.44±0.62次)。這些結(jié)果均表明SEM品系適合度較SEW有明顯提高，與已有報(bào)道的多數(shù)實(shí)驗(yàn)室發(fā)現(xiàn)的黑化昆蟲適合度較正常品系普遍降低的現(xiàn)象正好相反。綜合分析本研究結(jié)果和已有報(bào)道的14例黑化昆蟲的適合度變化研究結(jié)果，黑化昆蟲的適合度變化不依賴于黑化來(lái)源、黑化時(shí)期和黑化類型等因素。
　　2酪氨酸羥化酶過量表達(dá)是甜菜夜蛾SEM產(chǎn)生的主要

5、原因
　　運(yùn)用簡(jiǎn)并引物PCR克隆得到酪氨酸羥化酶(Tyrosine hydroxylase，TH)基因、多巴脫羧酶（Dopa decarboxylase，DDC）基因和漆酶2（Laccase2）基因片段，并通過RT-PCR方法比較了SEW和SEM品系中三個(gè)基因的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)SEM品系中TH和DDC過表達(dá);運(yùn)用RACE技術(shù)克隆分別得到兩品系TH和DDC的cDNA序列，且運(yùn)用qRT-PCR技術(shù)研究了這兩個(gè)基因在SEW和SEM品系化蛹

6、前后表皮組織中的表達(dá)譜;序列比對(duì)分析結(jié)果表明SEW和SEM品系的TH和DDC編碼的氨基酸序列沒有差異;在SEW和SEM化蛹前后，TH表達(dá)豐度普遍高于DDC,在預(yù)蛹期，SEM中TH和DDC相對(duì)表達(dá)量分別是SEW中的15.19倍和32.44倍，在0h蛹期，DDC在SEM品系的相對(duì)表達(dá)量是SEW中的3.08倍;通過注射dsRNA干擾SEM五齡幼蟲的TH,能在一定程度上使SEM蛹色變淺;用TH的抑制劑(3-IT)飼喂SEM品系五齡幼蟲至化蛹，蛹

7、的黑色變淺程度隨3-IT濃度提高而增大，0.75 mg/g3-IT可以使68.2％SEM蛹黑色出現(xiàn)變淺;當(dāng)用1 mg/g DDC的抑制劑(L-α-Methyl-DOPA)飼喂SEM品系五齡幼蟲至化蛹，只有20％ SEM蛹的黑色發(fā)生較小程度的變淺。結(jié)果表明TH和DDC的過量表達(dá)與SEM品系的蛹黑表型相關(guān)，且TH的作用比DDC更重要。
　　3酪氨酸羥化酶基因啟動(dòng)子結(jié)構(gòu)預(yù)示復(fù)雜的調(diào)控機(jī)制
　　通過Genome Walking技術(shù)克

8、隆得到美國(guó)甜菜夜蛾正常型(US wild-type)、SEW品系和SEM品系的TH轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游2.38kb啟動(dòng)子序列;運(yùn)用JASPAR數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)TH基因啟動(dòng)子區(qū)的順勢(shì)作用元件進(jìn)行預(yù)測(cè)，找到24個(gè)轉(zhuǎn)錄因子100％相似的作用元件，數(shù)目共計(jì)55個(gè);在TH啟動(dòng)子區(qū)內(nèi)找到7個(gè)類似核受體轉(zhuǎn)錄因子βFTZ-f1作用元件的位點(diǎn);運(yùn)用雙螢光素酶報(bào)告分析系統(tǒng)，在Sf9昆蟲細(xì)胞中研究了TH基因啟動(dòng)子活性，定位了TH基因啟動(dòng)子基礎(chǔ)活性區(qū)域和調(diào)控區(qū)域。

9、　　4βFTZ-f1基因在甜菜夜蛾SEM中過量表達(dá)
　　綜合運(yùn)用Genome Walking技術(shù)和3'RACE技術(shù)克隆得到甜菜夜蛾US wildtype、SEW和SEM品系的βFTZ-f1的cDNA序列，并且運(yùn)用RT-PCR和qRT-PCR技術(shù)研究了βFTZ-f1在SEW和SEM品系化蛹前后表皮組織中的表達(dá)譜;序列比對(duì)分析結(jié)果表明SEW和SEM品系的βFTZ-f1編碼的氨基酸序列有一個(gè)氨基酸不同，SEM品系和US wild-typ

10、e有四處氨基酸差異;預(yù)蛹晚期βFTZ-f1表達(dá)水平最高，在SEM表皮中的表達(dá)量是SEW中的7.48倍;0h蛹期，βFTZ-f1在SEM表皮中的表達(dá)量是SEW中的1.74倍;說(shuō)明βFTZ-f1基因過表達(dá)可能與SEM蛹黑表型形成有關(guān)。
　　5酪氨酸羥化酶基因受到β FTZ-f1和FTZ的正向調(diào)節(jié)
　　運(yùn)用真核表達(dá)載體和雙螢光素酶報(bào)告分析系統(tǒng)，在Sf9昆蟲細(xì)胞和人的HeLa細(xì)胞中過表達(dá)βFTZ-f1分別可以將TH啟動(dòng)子活性提高2.

11、66倍和1.6倍;Sf9細(xì)胞內(nèi)過表達(dá)βFTZ-f1的輔激活子FTZ可以將TH啟動(dòng)子活性顯著地提高1.79倍;通過EMSA試驗(yàn)在TH啟動(dòng)子區(qū)定位了一個(gè)FTZ的結(jié)合位點(diǎn)，未能定位到βFTZ-f1結(jié)合位點(diǎn);FTZ結(jié)合位點(diǎn)的缺失和突變不影響βFTZ-f1和FTZ對(duì)TH啟動(dòng)子活性的上調(diào)作用;最后，構(gòu)建TH啟動(dòng)子的截短載體結(jié)果證明在TH轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游-2200～-2160區(qū)段內(nèi)可能存在βFTZ-f1的結(jié)合位點(diǎn)。
　　綜上所述，SEM品系適合