TET蛋白突變體的制備及其性質(zhì)的研究.pdf

1、TET(Ten-Eleven-Translocation)蛋白是一種Fe2+和α-酮戊二酸依賴(lài)的雙加氧酶,具有催化5-甲基胞嘧啶轉(zhuǎn)化為5-羥甲基胞嘧啶的功能。TET蛋白通過(guò)調(diào)節(jié)基因組中5-甲基胞嘧啶和5-羥甲基胞嘧啶的含量,從而影響基因表達(dá)調(diào)控、印記基因的發(fā)生和腫瘤的形成。
　　目前人們?cè)赥ET的研究中發(fā)現(xiàn)3種具有催化5-甲基胞嘧啶羥基化保守活性區(qū)域的蛋白,分別稱(chēng)為T(mén)ET1,TET2,TET3。我們通過(guò)PCR方法從人和斑馬魚(yú)基因組

2、cDNA文庫(kù)中擴(kuò)增出了4種TET蛋白家族成員保守區(qū)域基因片段,將其克隆到pET28b表達(dá)載體上,通過(guò)點(diǎn)突變方法對(duì)目的基因進(jìn)行初步的密碼子優(yōu)化。我們根據(jù)TET蛋白家族成員保守區(qū)域特點(diǎn),在優(yōu)化密碼子突變體基礎(chǔ)上構(gòu)建了16種TET蛋白突變體,通過(guò)改變誘導(dǎo)培養(yǎng)條件,構(gòu)建SUMO和TET突變體融合蛋白,構(gòu)建trigger factor與TET共表達(dá)體系,摸索出TET蛋白表達(dá)及可溶性最佳條件。我們對(duì)于以包涵體形式存在的TET突變體蛋白沉淀用尿素等強(qiáng)

3、變性劑溶解,通過(guò)鎳螯合柱親和層析方法獲得8種變性TET突變體蛋白,用自己配制的96種不同蛋白復(fù)性溶液,對(duì)變性TET突變體蛋白進(jìn)行復(fù)性,利用圓二色譜儀和熒光光譜儀分別表征復(fù)性后的TET突變體蛋白的結(jié)構(gòu)性質(zhì)。
　　本課題研究發(fā)現(xiàn)密碼子優(yōu)化后的TET突變體在大腸桿菌中表達(dá)量增加,大腸桿菌表達(dá)得到的TET突變體蛋白幾乎以包涵體形式存在。融合蛋白SUMO及分子伴侶triggerfactor能夠提高部分TET突變體蛋白可溶性。通過(guò)復(fù)性溶液的篩