轉(zhuǎn)染mA20及其突變體對內(nèi)毒素血癥的影響和hA20突變體研究.pdf

1、第一部分基于流體動力學(xué)轉(zhuǎn)染mA20及其突變體對內(nèi)毒素血癥的治療作用 目的:研究mA20及其突變體mA20-ZnF4-7質(zhì)粒對脂多糖(LPS)攻擊所致實驗性內(nèi)毒素血癥的治療作用。 方法:用LPS攻擊小白鼠制備內(nèi)毒血癥動物模型。將實驗動物隨機分為：生理鹽水組、單純內(nèi)毒素組、空質(zhì)粒組、mA20 質(zhì)粒治療組和mA20-ZnF4-7質(zhì)粒治療組。按10μg質(zhì)粒：1.6ml生理鹽水比例把質(zhì)粒溶于生理鹽水中，采用基于流體動力學(xué)基因轉(zhuǎn)染方

2、法對實驗組小鼠進行質(zhì)粒治療性注射。以ELISA檢測各組血漿TNF-α、IL-1β表達(dá)；以逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)檢測白細(xì)胞中mA20及其突變體mRNA的表達(dá)；12小時觀察組織病理變化。 結(jié)果:(1)mA20 質(zhì)粒治療組、mA20-ZnF4-7質(zhì)粒治療組的TNF-α在各時間點的表達(dá)(pg/ml)分別為：6h：(201.797±4.789)、(235.710±6.108)，12h：(236.580±7.497)、(25

3、5.130±7.827)，24h：(154.551±16.460)、(223.246±11.316)；該兩組之間無顯著性差異(p>0.05)；與單純內(nèi)毒素組、空質(zhì)粒組的TNF-α表達(dá)比較有顯著性降低(p<0.05)。mA20 質(zhì)粒治療組、mA20-ZnF4-7質(zhì)粒治療組的IL-1β在各時間點的表達(dá)(pg/ml)分別為：6h：(87.103±3.840)、(101.586±2.486)，12h： (83.655±4.973)、(94.46

4、0±3.110)，24h：(77.678±6.555)，(87.103±4.826)；該兩組之間無顯著性差異(p>0.05)；與單純內(nèi)毒素組、空質(zhì)粒組的IL-1β表達(dá)比較有顯著性降低(p<0.05)；各時間點之間比較無明顯差別(p>0.05)。(2)mA20質(zhì)粒治療組、mA20-ZnF4-7質(zhì)粒治療組的mA20及其突變體mRNA表達(dá)與空質(zhì)粒組、單純內(nèi)毒素組、生理鹽水組比較有顯著性升高(p<0.01)?？召|(zhì)粒組、單純內(nèi)毒素組的mA20及其

5、突變體mRNA表達(dá)與生理鹽水組比較有顯著性升高(p<0.05)；各時間點之間比較無明顯差別(p>0.05)。(3)病理學(xué)觀察結(jié)果顯示：mA20治療組、mA20-ZnF4-7治療組的肝、肺損傷均較單純內(nèi)毒素組、空質(zhì)粒組輕；與生理鹽水對照組相比，肝、肺損傷無明顯差別。 結(jié)論:“基于流體動力學(xué)的基因轉(zhuǎn)染方法”能有效地把目的質(zhì)粒DNA 轉(zhuǎn)入肝、肺；對實驗性類毒素血癥小鼠體外轉(zhuǎn)染mA20-ZnF4-7和 mA20 有相似的治療作用，這為其

6、臨床應(yīng)用提供一定的實驗基礎(chǔ)。 第二部分基于流體動力學(xué)轉(zhuǎn)染mA20及其突變體對內(nèi)毒素血癥的預(yù)防作用 目的:研究 mA20及其突變體mA20-ZnF4-7質(zhì)粒轉(zhuǎn)染對LPS攻擊所致實驗性內(nèi)毒素血癥的預(yù)防作用。 方法:用LPS攻擊小白鼠制備內(nèi)毒血癥動物模型。按10μg質(zhì)粒：1.6ml 生理鹽水比例把質(zhì)粒溶于生理鹽水中，采用“基于流體動力學(xué)基因轉(zhuǎn)染方法”對實驗組小鼠進行質(zhì)粒預(yù)防性注射。以 ELISA 檢測各組血漿TNF-α

7、、IL-1β表達(dá)；以逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)檢測白細(xì)胞中mA20及其突變體mRNA的表達(dá)；12小時觀察組織病理變化。 結(jié)果:(1)mA20質(zhì)粒治療組、mA20-ZnF4-7 質(zhì)粒治療組的TNF-α在各時間點表達(dá)(pg/ml)分別為：6h：(211.942±9.133)、(163.536±0.502)，12h：(195.130±26.318)、(206.446±34.797)，24h：(182.963±14.527)

8、、(158.029±19.176)；與空質(zhì)粒組、單純內(nèi)毒素組的TNF-α表達(dá)比較有顯著性降低(p<0.05)。mA20質(zhì)粒治療組、mA20-ZnF4-7質(zhì)粒治療組的IL-1β在各時間點表達(dá)(pg/ml)分別為：6h：(137.908±4.487)、(138.598±8.733)，12h：(137.678±3.539)、(137.448±7.953)，24h：(129.862±11.602)、(126.873±6.942)；與空質(zhì)粒組、單

9、純內(nèi)毒素組的IL-1β表達(dá)比較有顯著性降低(p<0.05)；各時間點之間無顯著性差異(p>0.05)；(2)mA20質(zhì)粒治療組、mA20-ZnF4-7質(zhì)粒治療組的mA20及其突變體mRNA 表達(dá)與空質(zhì)粒組、單純內(nèi)毒素組、生理鹽水組比較有顯著性升高?？召|(zhì)粒組、單純內(nèi)毒素組的mA20及其突變體mRNA表達(dá)與生理鹽水組比較有顯著性升高；各時間點之間無顯著性差異(p>0.05)；(3)病理觀察結(jié)果顯示，mA20質(zhì)粒治療組、mA20-ZnF4-7

10、質(zhì)粒治療組的肝、肺損傷均較空質(zhì)粒組、單純內(nèi)毒素組輕；與生理鹽水組相比，肝、肺損傷無明顯差別。 結(jié)論:“基于血流動力學(xué)的基因轉(zhuǎn)染方法”能有效果地把目的質(zhì)粒DNA 轉(zhuǎn)入肝、肺，對實驗性內(nèi)毒素血癥小鼠體外轉(zhuǎn)染mA20-ZnF4-7和 mA20 有相似的預(yù)防作用，這也為臨床應(yīng)用進一步提供一定的實驗基礎(chǔ)。 第三部分脂質(zhì)體包裹mA20及其突變體對內(nèi)毒素血癥的治療作用 目的:研究脂質(zhì)體包裹 A20 及其突變體mA20-ZnF4

11、-7質(zhì)粒對LPS攻擊所致實驗性內(nèi)毒素血癥的治療作用。 方法:用LPS攻擊小白鼠制備內(nèi)毒素血癥動物模型。隨機分為：生理鹽水對照組(NS組)、單純內(nèi)毒素組、空質(zhì)粒組、脂質(zhì)體包裹mA20質(zhì)粒治療組(L-mA20組)、脂質(zhì)體包裹mA20A質(zhì)粒治療組(L-mA20A組)。采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)法制備脂質(zhì)體，并按200μl脂質(zhì)體：10μg 質(zhì)粒的比例作為每只小鼠的使用量。采用尾靜脈注射脂質(zhì)體包裹質(zhì)粒的溶液，提取血漿、分離白細(xì)胞、留取肝肺；以ELISA

12、檢測各組血漿TNF-α、IL-1β表達(dá)；以逆轉(zhuǎn)錄.聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)檢測白細(xì)胞中 mA20極其突變體mRNA的表達(dá)；并于12小時點觀察組織病理變化。 結(jié)果:(1)L-mA20組和 L-mA20Δ組的TNF-α在各時間點表達(dá)(pg/ml)分別為：6h：(304.696±6.087)、(304.985±6.291)，12h：(321.217±10.579)、(256.580±33.524)，24h：(307.594±11

13、.181)、(280.348±11.698)；與單純內(nèi)毒素組、空質(zhì)粒組的TNF-α表達(dá)比較有顯著性降低(p<0.05)。L-mA20組和L-mA20Δ組的IL-1β在各時間點表達(dá)(pg/ml)分別為：6h：(256.989±3.921)、(263.655±5.645)，12h：(205.724±4.827)、(154.690±1.380)，24h：(165.724±7.772)、(101.816±3.259)；依時間有顯著性下降趨勢；與

14、單純內(nèi)毒素組、空質(zhì)粒組的IL-1β表達(dá)比較有顯著性降低(p<0.05)；L-mA20Δ組24h點的IL-1β與6h點比較有顯著性降低(p<0.05)；(2)mA20質(zhì)粒治療組、mA20-ZnF4-7質(zhì)粒治療組的mA20及其突變體mRNA表達(dá)與空質(zhì)粒組、單純內(nèi)毒素組、生理鹽水組比較有顯著性升高?？召|(zhì)粒組、單純內(nèi)毒素組的 mA20及其突變體mRNA表達(dá)與生理鹽水組比較有顯著性升高；(3)病理觀察結(jié)果顯示：L-mA20組和L-mA20A組的肝

15、、肺損傷均較單純內(nèi)毒素組、空質(zhì)粒組輕；與NS相比，肝、肺損傷無明顯差別。 結(jié)論:尾靜脈注射脂質(zhì)體包裹mA20及其突變體mA20-ZnF4-7質(zhì)粒對內(nèi)毒素血癥小鼠有相似的治療作用，為臨床用脂質(zhì)體包裹質(zhì)粒DNA治療內(nèi)毒素血癥作好鋪墊，為臨床應(yīng)用結(jié)構(gòu)更簡單的A20蛋白提供了一定實驗基礎(chǔ)。 第四部分人鋅指蛋白A20基因突變提構(gòu)建及真核表達(dá)初步研究 目的:采用分子設(shè)計軟件設(shè)計并構(gòu)建人鋅指蛋白A20基因突變體，轉(zhuǎn)染小鼠RAW

16、264.7真核表達(dá)細(xì)胞，檢測其對LPS刺激的 RAW264.7細(xì)胞的抗炎活性。 方法:采用分子設(shè)計軟件對hA20基因進行分析，把第 332 位到第1778位基因剔除。使用核酸內(nèi)切酶AccⅢ酶切真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3-FlaghA20，使其成線性后。再采用DNA連接酶對質(zhì)粒進行自連反應(yīng)，將重組子轉(zhuǎn)染JM109，挑取菌落，用PCR和酶切方法鑒定真假陽性克隆。使用小鼠RAW264.7巨噬細(xì)胞作為研究對象，并完全隨機分為：單純LPS刺

17、激組、hA20全長質(zhì)粒組和hA20N-ZnF4-7質(zhì)粒組。應(yīng)用Lipofectamine2000 真核轉(zhuǎn)染系統(tǒng)轉(zhuǎn)染 LPS 刺激的RAW264.7細(xì)胞，用ELISA 檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清的TNF-α、IL-1β表達(dá)變化。 結(jié)果:通過PCR、酶切可見部分克隆片段只為923bp，即全長hA20經(jīng)AccⅢ酶切后的片段；送檢測序，顯示構(gòu)建成功；RAW264.7細(xì)胞培養(yǎng)上清的TNF-α、IL-1β表達(dá)(pg/ml)分別為：單純 LPS 刺激組