家蠶成蟲期特異黑化突變從性黑蛾(sml)的定位克隆及分子機(jī)制研究.pdf

1、昆蟲是地球上最繁盛的動(dòng)物類群，種類多，分布廣，形態(tài)多樣。其豐富多樣的體色模式，長(zhǎng)期受到世界各國(guó)研究者的高度關(guān)注，一直是生物學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。黑化是昆蟲普遍而主要的著色模式，不僅能產(chǎn)生豐富的表型多形性，還在適應(yīng)性進(jìn)化等方面起著重要作用。昆蟲的黑化現(xiàn)象主要是由黑色素積累引起的。目前，昆蟲黑色素生物合成過(guò)程的基因、蛋白質(zhì)和相關(guān)的代謝物質(zhì)，在眾多昆蟲中已經(jīng)被比較系統(tǒng)地研究。然而，越來(lái)越多的研究表明，昆蟲黑化除了與黑色素合成代謝途徑的基因密切相關(guān)

2、之外，也可能受其他基因或遺傳位點(diǎn)的調(diào)控，這表明昆蟲黑化的分子機(jī)制復(fù)雜多樣，還有待進(jìn)一步研究。
　　家蠶是重要的農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)昆蟲，也是鱗翅目昆蟲的模式生物，在害蟲防治與生物科學(xué)研究上有著重要地位。超過(guò)百年的家蠶遺傳學(xué)研究為我們累積了大量的體色突變遺傳資源。以往對(duì)家蠶體色突變體的大量研究，增強(qiáng)了我們對(duì)家蠶色素沉著過(guò)程和昆蟲黑化現(xiàn)象的遺傳機(jī)制的基本認(rèn)識(shí)，還為進(jìn)一步闡明昆蟲體色調(diào)控機(jī)制提供了理論參考和技術(shù)支撐。
　　從性黑蛾（sex-c

3、ontrolled melanism,sml）是本研究團(tuán)隊(duì)新發(fā)現(xiàn)的家蠶成蟲期特異黑化突變體。它是一種常染色體隱性自發(fā)突變，且只有sml雄蛾表現(xiàn)出明顯的黑化表型。之前的遺傳分析表明，該黑化突變體不同于以往報(bào)道的黑化變異，暗示未知的新基因（新機(jī)制）導(dǎo)致了此黑化表型。本研究選擇黑化突變sml作為研究對(duì)象，利用定位克隆等多種技術(shù)確定變異位點(diǎn)，并對(duì)候選基因的相關(guān)功能及黑化調(diào)控機(jī)制進(jìn)行研究。獲得的主要研究結(jié)果如下：
　　1.家蠶從性黑蛾（sm

4、l）的表型觀察與分析
　　為了探明家蠶從性黑蛾（sml）的具體表型特征，我們對(duì)其表型進(jìn)行了連續(xù)的觀察分析。其基本體色特征為：幼蟲和蛹體色為普通型，雄蛾灰黑色（突變型），雌蛾為野生型體色（白色或略帶灰色）。在標(biāo)準(zhǔn)飼養(yǎng)條件下，蛹8天之前，sml雄性個(gè)體與其雌性及野生型品系的體色沒有明顯差異；發(fā)育到蛹8天后，sml雄性個(gè)體顏色逐漸加深，變黑；進(jìn)入蛹9天時(shí)，sml雄性個(gè)體全身黑色；蛹9天的后半天（蛹期持續(xù)約9天）陸續(xù)羽化為黑蛾。通過(guò)組織部

5、位的比較觀察結(jié)果顯示：sml雄蛾主要表現(xiàn)為鱗片黑化，其背板、觸角以及羽化后的蛹?xì)さ冉M織部位的顏色與其雌性或野生型個(gè)體沒有明顯差異。
　　在幼蟲期對(duì)雌雄差異器官（生殖器官原基：生殖腺和生殖芽等）的摘除實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：摘除生殖腺（精巢、卵巢）和生殖芽（雄性為赫氏腺，雌性為石渡氏腺），對(duì)sml雌雄個(gè)體的蛾體色沒有產(chǎn)生明顯影響。由此推測(cè)：生殖腺和生殖芽等生殖腺體對(duì)sml成蟲體色沒有決定性的調(diào)控作用。
　　對(duì)成蟲存活時(shí)間的統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果顯

6、示：在未交配的情況下，野生型對(duì)照組家蠶品系（普通蛾體色）雌蛾存活時(shí)間均比雄蛾長(zhǎng)，且差異顯著；sml雌蛾（普通蛾體色）的存活時(shí)間與對(duì)照組相當(dāng)，而sml雄蛾（黑化）存活時(shí)間顯著延長(zhǎng)，并且顯著長(zhǎng)于雌蛾。表明：sml黑化個(gè)體（雄性黑蛾）存活時(shí)間更長(zhǎng)。這一結(jié)果暗示：在某些情況下，昆蟲的黑化可能會(huì)增強(qiáng)個(gè)體的生命力，延長(zhǎng)存活時(shí)間。
　　2.家蠶從性黑蛾（sml）的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析
　　為了全面地調(diào)查與sml雄蛾突變表型相關(guān)的轉(zhuǎn)錄組水平信息，

7、我們選用開始黑化（蛹8天）的sml和野生型Dazao品系（分雌雄）樣本，進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序比較分析。4個(gè)樣品文庫(kù)依次為：sml雄（編號(hào)為 sml_M），sml雌（編號(hào)為 sml_F）。Dazao雄（編號(hào)為DZ_M）和Dazao雌（編號(hào)為DZ_F）。
　　3個(gè)黑-白配對(duì)比較組（sml_MVS sml_F，sml_MVSDZ_M和sml_MVSDZ_F）分別有168、503和623個(gè)差異表達(dá)基因（DEGs）。我們通過(guò)構(gòu)建維恩圖排除因遺傳背

8、景和性別差異導(dǎo)致的差異表達(dá)基因后，共篩選到59個(gè)主要與黑化表型相關(guān)的DEGs。
　　基于轉(zhuǎn)錄組表達(dá)數(shù)據(jù)和功能注釋，我們分析發(fā)現(xiàn)：與三個(gè)白蛾樣本相比，這59個(gè)DEGs在黑蛾樣本（sml雄）中有49個(gè)基因上調(diào)表達(dá)，10個(gè)基因下調(diào)表達(dá)；其中有24個(gè)（約占59個(gè)候選DEGs的41％）表皮蛋白基因，包括7個(gè)CPR（含R&R共有序列的表皮蛋白）、7個(gè)CPG（富含甘氨酸的表皮蛋白）、1個(gè)CPT（含Tweedle基序的表皮蛋白）和9個(gè)CPH（假定

9、表皮蛋白）基因。22個(gè)表皮蛋白基因的表達(dá)量在黑蛾樣本（sml雄）中顯著上調(diào)，暗示這些表皮蛋白基因與sml黑化表型相關(guān)（如：可能參與黑色素轉(zhuǎn)運(yùn)或附著）。另外我們發(fā)現(xiàn)：昆蟲黑色素生物合成過(guò)程的2個(gè)關(guān)鍵基因laccase2（BGIBMGA006745）和yellow（BGIBMGA001149），在sml黑蛾樣本中表達(dá)量顯著上調(diào)，暗示sml黑化基因能通過(guò)上調(diào)yellow和laccase2的基因表達(dá)量，調(diào)節(jié)家蠶黑色素生物合成通路，進(jìn)而產(chǎn)生黑蛾表

10、型。同時(shí)，我們發(fā)現(xiàn)laccase2 B亞型轉(zhuǎn)錄本（BGIBMGA006746）也在sml黑蛾樣本中顯著高表達(dá)，說(shuō)明該亞型可能參與家蠶蛹后期及其后的黑化過(guò)程。除此之外，我們還在候選DEGs中發(fā)現(xiàn)1個(gè)過(guò)氧化氫酶基因（BGIBMGA011430）和1個(gè)胰島素類似蛋白基因（家蠶素E-1，BGIBMGA000667）。據(jù)報(bào)道，這兩類蛋白可以影響生物壽命，這可能為研究sml成蟲期壽命延長(zhǎng)現(xiàn)象的分子機(jī)理提供重要線索。
　　3.從性黑蛾（sml）

11、位點(diǎn)的分子定位分析
　　利用分布于家蠶各連鎖群（染色體）的形態(tài)標(biāo)記和簡(jiǎn)單重復(fù)序列（Simple Sequence Repeat，SSR）分子標(biāo)記對(duì)sml進(jìn)行連鎖分析，結(jié)果顯示：sml位點(diǎn)與位于第17連鎖群（第17染色體）的分子標(biāo)記連鎖，而與其它連鎖群的分子或形態(tài)標(biāo)記均為獨(dú)立遺傳關(guān)系，由此判斷sml突變位點(diǎn)位于家蠶第17染色體。
　　我們利用分子標(biāo)記和小規(guī)模定位群體（159個(gè)BC1M個(gè)體）對(duì)sml位點(diǎn)進(jìn)行了初步定位，并構(gòu)建了分

12、子標(biāo)記連鎖圖譜，將 sml位點(diǎn)初步鎖定在17號(hào)染色體nscaf2829上的分子標(biāo)記M3和M11之間。sml位點(diǎn)與M3和M11的遺傳距離分別為1.9cM和3.1cM。在初定位區(qū)間中補(bǔ)充新的分子標(biāo)記后，我們利用大規(guī)模的定位群體（1573個(gè)BC1M個(gè)體）進(jìn)行了精細(xì)定位，最終將sml位點(diǎn)鎖定在標(biāo)記M5和M9之間，區(qū)間長(zhǎng)度約403kb，且在區(qū)間內(nèi)發(fā)現(xiàn)3個(gè)與sml位點(diǎn)緊密連鎖（不交換）的標(biāo)記（M6、M7和M8）。
　　蛾體色是家蠶的一個(gè)馴化性

13、狀。因此，我們通過(guò)ROD（reduction of diversity）法，對(duì)多個(gè)品系的家蠶（白蛾）和野蠶（蛾體色黑，斑紋偏多）的基因組重測(cè)序數(shù)據(jù)的SNP（Single Nucleotide Polymorphisms單核苷酸多態(tài)性）進(jìn)行了分析，篩查了家蠶基因組中的馴化選擇靶點(diǎn)，并通過(guò)Tajima’D檢驗(yàn)等方法驗(yàn)證靶點(diǎn)的可靠性。結(jié)果表明：sml定位區(qū)間受馴化選擇強(qiáng)度較大，是家蠶馴化選擇的候選靶點(diǎn)，說(shuō)明該區(qū)域與蛾體色調(diào)控和馴化緊密相關(guān)。<

14、br>　　4.候選基因篩查、克隆及功能研究
　　定位區(qū)間內(nèi)共有23個(gè)預(yù)測(cè)基因。為了篩選候選基因，我們采用熒光定量PCR技術(shù)調(diào)查區(qū)間內(nèi)基因的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)區(qū)間內(nèi)有4個(gè)基因（BGIBMGA005552、BGIBMGA005557、BGIBMGA005652和BGIBMGA005662）在sml突變體中的表達(dá)量顯著低于野生型Dazao。
　　基因功能注釋結(jié)果顯示：BGIBMGA005652是保守的細(xì)胞周期調(diào)控因子 fizzy基因家族成

15、員，它在袖蝶中的同源基因（poik）能調(diào)控?cái)M態(tài)的色彩模式；BGIBMGA005557編碼一個(gè)ATP結(jié)合蛋白，具有轉(zhuǎn)移酶活性和核苷酸磷酸酶活性，在果蠅中的直系同源基因能調(diào)控翅的形態(tài)發(fā)生；BGIBMGA005552編碼一個(gè)平滑肌鈣調(diào)素結(jié)合蛋白，其在果蠅中的直系同源基因參與神經(jīng)細(xì)胞的發(fā)育過(guò)程；BGIBMGA005662編碼一個(gè)WD40重復(fù)結(jié)構(gòu)域蛋白，在果蠅中的直系同源基因有去甲基化酶活性。
　　我們克隆了sml突變中這幾個(gè)基因的cDNA

16、及基因組序列，并且分析比較了它們與野生型序列的差異。結(jié)果顯示：與野生型Dazao相比。sml中基因BGIBMGA005557的轉(zhuǎn)錄區(qū)和基因上下游均有大量的短片段的插入缺失和堿基替換突變，致使ORF框被破壞，無(wú)法正常翻譯為功能蛋白；基因BGIBMGA005652上游約5kb的位置有一段長(zhǎng)約20kb的大片段缺失；基因BGIBMGA005552的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游有短片段的插入突變和大量堿基替換變異；基因BGIBMGA005662內(nèi)含子和轉(zhuǎn)錄區(qū)

17、下游有短片段的插入突變和大量堿基替換變異。
　　為了驗(yàn)證這幾個(gè)候選基因的缺陷是否能導(dǎo)致黑化表型，我們通過(guò) RNAi技術(shù),下調(diào)了它們?cè)谝吧蛡€(gè)體中的mRNA表達(dá)量,結(jié)果顯示，下調(diào)BGIBMGA005552、BGIBMGA005557和BGIBMGA005652基因表達(dá)量后，野生型蠶蛾產(chǎn)生不同程度的黑化表型；在基因BGIBMGA005662 RNAi干涉組中未見黑化表型個(gè)體。我們推測(cè)，基因BGIBMGA005552、BGIBMGA00

18、5557和BGIBMGA005652均參與家蠶成蟲體色調(diào)控，sml的黑化表型可能是由多基因的功能缺陷或異常表達(dá)共同導(dǎo)致的。
　　由于sml雄蛾表現(xiàn)為黑化表型，而前期的轉(zhuǎn)錄組實(shí)驗(yàn)結(jié)果也顯示突變體中黑色素生物合成過(guò)程中的部分基因表達(dá)異常，所以我們采用熒光定量PCR技術(shù)調(diào)查了黑色素生物合成過(guò)程中關(guān)鍵基因的表達(dá)模式。結(jié)果顯示：黑色素形成和沉積過(guò)程中的關(guān)鍵基因yellow和laccase2在野生型個(gè)體蛹復(fù)眼著色后有一個(gè)表達(dá)高峰；它們?cè)趕ml

19、雄蛾（黑化）中的表達(dá)模式與野生型相似，但表達(dá)量顯著的高于野生型，且yellow基因在蛹7天的相對(duì)表達(dá)水平極高；其余基因的表達(dá)差異不明顯。由此我們推測(cè)，sml的候選基因能通過(guò)控制蛹后期yellow和laccase2的基因表達(dá)水平（主要是yellow基因），調(diào)節(jié)黑色素的生物合成，進(jìn)而調(diào)控家蠶蛾體色。
　　5.鱗翅目昆蟲中sml同源區(qū)域的生物信息分析
　　在不同鱗翅目昆蟲物種中，對(duì)sml位點(diǎn)所在的基因組區(qū)域進(jìn)行了同源比對(duì)和生物信息

20、分析。研究發(fā)現(xiàn)，sml的候選基因組區(qū)域與其它鱗翅目昆蟲的體色調(diào)控區(qū)域（HmYb、P、Cr和 carbonaria）同源，表明此區(qū)域是鱗翅目昆蟲中控制成蟲體色模式的保守調(diào)控位點(diǎn)。同時(shí)我們還發(fā)現(xiàn)。sml位點(diǎn)中有2個(gè)候選基因BGIBMGA005557和BGIBMGA005652位于樺尺蠖工業(yè)黑化核心調(diào)控區(qū)域的同源區(qū)域中。樺尺蠖工業(yè)黑化現(xiàn)象是自然選擇的一個(gè)經(jīng)典案例，但先前的研究只鑒定了控制工業(yè)黑化的染色體區(qū)域carbonaria。值得注意的是，